Communication & manque de communication avec les proches

Os isolados analisados apresentaram diferentes perfis genotípicos relacionados à presença ∕ ausência de genes que codificam sistemas de efluxo multidrogas (Tabela 1). Observa-se que todos os 27 isolados apresentaram pelo menos um sistema de efluxo multidrogas, o que poderia inferir presença de resistência aos antimicrobianos testados, porém, isso não foi observado no perfil fenotípico destes isolados. Apenas 4 isolados de E. coli 13, 21, 24 e 27 exibiram perfil de

multirresistência, ampicilina e sulfametoxazol∕trimetoprim. A ausência do perfil fenotípico de resistência e a presença de genes que compõem mecanismos de resistência nem sempre estão relacionados. Os genes podem não estar sendo expresso; ou sendo expressos em um nível não detectado pelo teste usado, e durante todo o processo, os produtos podem sofrer alterações que resultam na inativação dos mesmos. A Figura 2 apresenta a porcentagem dos diferentes genes detectados pela PCR em todos os isolados analisados.

Trabalhos realizados por NIKAIDO, (2009) e POS, (2009), reportam que em bactérias Gram-negativas há necesidade de um sistema tripartido para lançar a droga do meio interno para o meio externo. No presente estudo foi analisado a presença de apenas dois componentes desses sistemas, e observou-se em 14 isolados (56%) ausência de alguns genes (Tabela 1) referentes a essas duas proteínas estudadas, a proteína de membrana plasmática e a proteína de fusão de membrana. GERKEN e MISRA (2004) observaram que é possível ligações cruzadas entre AcrA e TolC sem a presença de AcrB, sugerindo que AcrB não é escencial para interações in vivo entre TolC-AcrA. Infere-se a existencia de ligações cruzadas tambem para proteinas pertencentes aos outros sistemas de efluxo pois há necessitade de tres componentes compondo o sistema de elfuxo devido a estrutura da bacteria gram negativa. No presente trabalho, o gene da proteína TolC não foi avaliada, é uma porina que compoe mais de um sistema de efluxo multidrogas em E. coli (POS, 2009), A Figura 3 demonstra a amplificação dos genes que compoem os sistemas de efluxo multidrogas estudados de E. coli 21, exceto o gene acrF que não amplificou.

Tabela 1- Presença de genes de sistemas de efluxo multidrogas em Escherichia coli isolados de leite provenientes de bovinos com mastite clínica, detectados pela técnica de PCR.

+ : Presença do gene ; — : Ausência do gene; Isolados marcados: Resistentes a ampicilina e sulfametoxazol∕trimetoprim.

Os antimicrobianos utilizados neste trabalho são substratos dos sistemas de efluxo analisados (Quadro 1). A enrofloxacina pertence à família das fluoroquinolonas que são substratos dos três sistemas: AcrAB, AcrEF e EmrAB. Os β-lactâmicos, ampicilina, cefalaxina e ceftiufur são substratos dos sistemas efluxo multidrogas AcrAB e AcrEF, enquanto sulfametoxazol∕trimetoprim é substrato de AcrEF. Deste modo, esperava-se uma maior porcentagem de resistência nos isolados analisados, porém, apenas quatro isolados (14,8%)

Isolados Genes

acrA acrB acrE acrF emrA emrB

1 - - + + - - 2 + + + + - - 3 + + + + - - 4 - - + + + + 5 + + + + - + 6 + + - - - - 7 + + + + - - 8 + + + + - - 9 - - - - + + 10 + + - - + + 11 + + + + - - 12 - + + + - - 13 + + + + + + 14 - - - + + + 15 + + + - - + 16 + + - + - - 17 + + + + - - 18 - + + + + + 19 + + + + - - 20 + + - - - - 21 + + - + - - 22 - - - - + + 23 + + + - + - 24 - - - + + + 25 + + - + + + 26 + + + + - + 27 + - + + + +

foram resistentes a ampicilina e a sulfametoxazol∕trimetoprim, sendo os demais classificados na categoria de sensíveis segundo o CLSI (2008). Existem outros sistemas de efluxo que não foram analisados neste trabalho, nos quais estes antimicrobianos também são substratos (Quadro 1).

No estudo realizado por MOREIRA et al. (2009), com isolados de E. coli e Enterobacter

cloacae, multirresistentes, provenientes de frangos clinicamente sadios foi utilizada a técnica de

PCR para identificar genes codificadores de AcrA e AcrB. Os autores observaram presença destes genes em todos os isolados de E. coli e em dois, de E. cloacae. Embora, nossos isolados de E. coli, eram provenientes de bovinos com mastite clínica, este trabalho concorda com os nossos achados pois os genes acrA e acrB tambem foram observados (Figura 4).

Figura 3- Porcentagem dos genes que codificam os três sistemas de efluxo multidrogas estudados em Escherichia coli detectados por PCR.

M: Lader; 1: gene acrA; 2: gene acrB; 3: gene acrE; 4: gene acrF; 5: gene emrA; 6: gene emrB; 7:controle negativo gene acrA; 8: controle negativo acrB 9:controle negativo gene acrE; 10:controle negativo gene acrF; 11: controle negativo gene emrA; 12: controle negativo gene emrB; 13: controle positivo gene acrA; 14: controle positivo gene acrB; 15: controle positivo gene acrE; 16: controle positivo acrF; 17 :controle positivo gene emrA; 18: controle positivo gene emrB.

5.3 Determinação da concentração inibitória mínima – CIM

As CIMs foram realizadas para todos os 27 isolados utilizando os dois antimicrobianos, ampicilina e sulfametoxazol∕trimetoprim, que compõe o perfil de resistência dos quatro isolados de E. coli.

Observaram-se valores de CIM para ampicilina variando de 6 µg/mL a 250 µg/mL e para sulfametoxazol∕trimetoprim de 12 µg/mL a 1500 µg/mL. Estas diferenças de CIM para um mesmo antimicrobiano sugerem diferentes perfis fenotípicos de resistência nesses isolados, mesmo sendo obtido de uma mesma fonte, leite de animais com mastite.Os maiores valores da CIM observados para ampicilina e sulfametoxazol ∕ trimetoprim foram de 250 µg/mL nos isolados de E. coli 13 e 21, seguido da CIM de 110 µg/mL dos isolados 24 e 27 e de 1500 µg/mL, verificada nos isolados de E. coli 13, 21, 24 e 27. Entretanto, os 23 isolados restantes apresentaram valores de CIM baixos, variando de 6 µg/mL a 12 µg/mL para ampicilina e de 12 µg/mL a 36 µg/mL para sulfametoxazol∕trimetoprim, sendo classificados na categoria de sensíveis, segundo o CLSI (2008) e confirmado pelo resultado do antibiograma.

Figura 4- Produtos de PCR de Escherichia coli 21 de genes que codificam três sistemas de efluxo multidrogas.

No estudo realizado por NISHINO et al. (2003), com cepas de E. coli, observaram que a CIM para β-lactâmicos (ampicilina, cefuroxima, e cefotaxima) aumentou de 2-8 vezes nas cepas que super expressavam o sistema de efluxo multidrogas AcrAB-TolC. Baseado no relato desses autores pode-se sugerir que as CIM elevadas para ampicilina de E. coli 13, 21, 24 e 27, em relação a dos sensíveis, é devido a atividade de sistemas de efluxo. JELLEN-RITTER e KERN (2001), trabalhando com cepas de E. coli, verificaram um amento da CIM para diferentes antimicrobianos entre esses, o trimetoprim, em cepas que expressavam os sistemas de efluxo AcrAB e AcrEF. No caso houve um aumento de ate 3 vezes em relação às cepas que não apresentavam esses sistemas.