Clivages protéolytiques des récepteurs NOTCH

qui suggère que les O-GlcNAc jouent aussi un rôle dans la modulation des interactions

NOTCH-ligands.

I.3.3.5 Modulation des interactions par l’O-glycosylation des ligands

Les ligands de Notch de drosophile, Delta et Serrate, sont O-fucosylés (Panin, Shao et al.

2002). Des analyses par spectrométrie de masse ont montré que les répétitions EGF-like 3, 4,

7 et 8 de DLL1 de souris étaient également O-fucosylés (Muller, Rana et al. 2014). Ces

O-fucosylations ne semblent pas impacter la fonction des ligands chez la drosophile ou chez les

mammifères (Muller, Rana et al. 2014), contrairement à ce que l’on observe pour les

récepteurs NOTCH.

I.3.4 Clivages protéolytiques des récepteurs NOTCH

Suite aux interactions récepteurs-ligands, le site S2 de la région NRR du récepteur est exposé

et clivé par des protéases de la famille ADAM. Ce clivage protéolytique est nécessaire à

l’activation de la voie Notch et indispensable à l’exposition ultérieure du site S3, dont le

clivage par le complexe de la gamma-sécrétase conduira à la libération de NICD.

I.3.4.1 Clivage du site S2 et devenir du NECD

Les protéases majoritairement impliquées dans le clivage du site S2 sont des protéases de la

famille ADAM, qui sont des protéines à une seul passage transmembranaire impliquées dans

la protéolyse de protéines de surface cellulaire, modulant ainsi les interactions cellule-cellule

et cellule-matrice (Blobel 2005). Ces protéases ADAM possèdent principalement un domaine

catalytique de type métalloprotéase dont l’activation dépend du zinc, un domaine

disintégrine et un domaine riche en cystéines (Figure 36). La protéolyse des récepteurs

NOTCH et de leurs ligands émerge comme l'une des fonctions clés des ADAM protéases.

ADAM17, appelée aussi TACE (tumor necrosis factor-α-converting enzyme), a été la

première protéase incriminée dans ce clivage du récepteur NOTCH (Brou, Logeat et al. 2000;

Mumm, Schroeter et al. 2000). Pourtant, chez la souris, ADAM10 serait la protéase

majoritairement impliquée dans l’activation de la voie Notch. En effet, la perte de

TACE/ADAM17 n’entraine pas de phénotype aussi marqué que celui observé chez les souris

KO pour Notch1 (Peschon, Slack et al. 1998). Par contre, les souris déficientes en ADAM10

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Figure 37 : Modèle d’activation de la voie Notch par une cellule exprimant le ligand Delta.

Avant toute interaction avec le récepteur Notch, le ligand Delta exprimé à la surface de la cellule émettrice est activé par

ubiquitinylation via Mib puis internalisé suite à l’interaction de son ubiquitine avec l’epsine. Il sera ensuite soit dégradé

par les lysosomes soit ré-exprimé à la surface, pour interagir avec un récepteur Notch de la cellule réceptrice. Par

recrutement de l’epsine puis de la clathrine, les ligands ubiquitinylés commencent à être endocytés par la cellule

émettrice, ce qui génère des forces de traction à l’égard du récepteur Notch. Le récepteur Notch se retrouve à l’état

dissocié : le NECD reste lié à son ligand puis est endocyté par la cellule émettrice pour être soit dégradé par les lysosomes

soit recyclé et ré-exprimé à la surface afin d’activer à nouveau d’autres cellules adjacentes. Le récepteur Notch,

débarrassé de son NECD, expose alors son site S2 au clivage protéolytique par une ADAM protéase. Par la suite, le clivage

des sites S3/S4 par le complexe de la gamma-secrétase entraine la libération du NICD et la translocation de celui-ci au

noyau pour activer des gènes cibles(D'Souza, Meloty-Kapella et al. 2010).(EE, Early endosome, LE, late endosomes, RE,

recycling endosomes, SE, sorting endosomes)

montrent une létalité à E9.5 (Hartmann, de Strooper et al. 2002), avec un phénotype sévère

similaire à celui des souris KO pour Notch1 (Shi and Stanley 2003) ou double KO pour les

γ-sécrétases appelées présenilines 1 et 2 (Herreman, Hartmann et al. 1999). Il semblerait en

fait que ADAM10 soit impliquée dans la voie canonique de Notch, où le clivage du récepteur

est la conséquence de la fixation d’un ligand alors que ADAM17 serait plus incriminée dans

la voie non canonique de Notch, indépendante de la fixation des ligands (Bozkulak and

Weinmaster 2009).

Des études structurales, basées sur la cristallisation de la région NRR de NOTCH2 humain,

révèlent que la région NRR est dans une conformation inactive dite « d’auto-inhibition » en

l’absence de ligand (Gordon, Vardar-Ulu et al. 2007). Au sein de cette région globulaire NRR,

le site de clivage extracellulaire S2 est profondément enfoui en raison d’une interaction

importante entre le domaine LNR et le domaine d'hétérodimérisation (HD), qui possèdent

tous deux des structures de type α-β-sandwich étroitement entrelacées pour maintenir la

région NRR dans cette configuration inactive (Chillakuri, Sheppard et al. 2012). Une étude

par RMN a montré que chacune des trois répétitions LNR est stabilisée par trois ponts

disulfures et un ion calcium (Vardar, North et al. 2003). Le rôle de cet ion Ca

²⁺

est important

dans le maintien de l’état inactif de la région NRR puisqu’en son absence, on observe une

activation du récepteur avec libération du NICD de manière indépendante du ligand (Rand,

Grimm et al. 2000). En temps normal, le site S2 n’est pas accessible pour le clivage S2 par les

ADAM. L’interaction du récepteur avec son ligand induit une invagination de la cellule

émettrice (qui porte le ligand lié au NECD) avec ou sans changement conformationnel au

niveau du site S2, ce qui va permettre l’exposition de ce site et donc son clivage (Chillakuri,

Sheppard et al. 2012) (Figure 37).

En cas d’absence d’interaction avec le récepteur NOTCH, le ligand Delta est la cible d’une

ubiquitinylation par Mib, avant d’être endocyté avec l’epsine par la cellule émettrice puis

recyclé à la membrane en tant que ligand capable de se fixer à son récepteur (D'Souza,

Meloty-Kapella et al. 2010) (Figure 37). Le ligand, qui se lie au récepteur NOTCH de la cellule

réceptrice, recrute l’epsine via son ubiquitinylation, ce qui conduit à la formation

d’invaginations de la cellule émettrice, recouvertes de clathrine. Ce sont ces invaginations de

la cellule émettrice qui permettent de générer une force physique nécessaire à la

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Figure 38 : Le complexe de la γ-sécrétase.

Le complexe de la γ-sécrétase est composé de quatre protéines transmembranaires hydrophobes : la préséniline, la

nicastrine, Aph-1 (2 isoformes : Aph-1a et 1b) et Pen-2. La Préséniline (2 isoformes : préséniline 1 et 2) contient le

domaine catalytique du complexe, impliquant deux résidus aspartates localisés dans les segments transmembranaires

6 et 7 (astérisques). Une fois les 4 protéines assemblées, le préséniline subit une endoprotéolyse au niveau de la boucle

unissant les segments transmembranaires 6 et 7, ce qui n’empêche ses domaines N-terminal (NTF) et C-terminal (CTF)

de rester associés de manière non covalente (Wakabayashi and De Strooper 2008).

dissociation du récepteur NOTCH (mécanisme lift and cut) (Fortini 2009; Chillakuri, Sheppard

et al. 2012) : le NECD reste accroché au ligand et est alors endocyté par la cellule émettrice.

Une fois internalisé, ce complexe ligand-NECD se dissocie dans les endosomes précoces. Le

ligand sera ensuite recyclé et le NECD dégradé par les lysosomes de la cellule émettrice.

Le récepteur NOTCH ainsi débarrassé de sa partie extracellulaire, suite au clivage du site S2

par une ADAM protéase, s’expose alors à d’autres clivages protéolytiques par le complexe de

la γ-sécrétase.

I.3.4.2 Clivage des sites S3/S4 et devenir du NICD libéré

Une fois le clivage S2 réalisé, le complexe de la γ-sécrétase va pouvoir cliver les sites

protéolytiques membranaires (S3/S4) du récepteur NOTCH. Le clivage du site S3 de NOTCH,

entre les résidus G1743 et V1744 (Schroeter, Kisslinger et al. 1998), permet la libération du

NICD, qui sera transloqué au noyau pour activer les gènes cibles et le clivage au niveau du

site S4 va libérer le peptide N (Okochi, Steiner et al. 2002).

Ce complexe de la γ-sécrétase comprend 4 sous-unités, dont la nicastrine, la protéine

précurseur de l’amyloïde (APP), la préséniline et enfin PEN-2 (presenilin enhancer 2) qui

stabilise le complexe (Figure 38). Le rôle catalytique de la préséniline vis-à-vis du récepteur

NOTCH a été mis en évidence chez la souris (De Strooper, Annaert et al. 1999) et la

drosophile (Struhl and Greenwald 1999), en montrant que cette préséniline entrainait bien

la libération du NICD après interaction d’un ligand avec le récepteur NOTCH. Il a été montré

aussi que cette préséniline pouvait cliver plusieurs protéines membranaires de type I telles

que le récepteur NOTCH et la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) (De Strooper, Annaert

et al. 1999) à l’origine de la formation des plaques amyloïdes du cerveau des patients

atteints de la maladie d’Alzheimer (Xia and Wolfe 2003). Parmi plus de 60 autres protéines

proposées comme substrats de la y-sécrétase (De Strooper, Iwatsubo et al. 2012), plusieurs

ligands DSL de mammifères et d'invertébrés sont des cibles potentielles. Toutefois, si cette

protéolyse des ligands est effective, sa signification réelle dans la signalisation Notch reste à

déterminer. Elle pourrait contribuer à réguler l’expression des ligands à la surface des

cellules ou à générer des fragments intracellulaires solubles, qui à l’image du NICD iraient

activer des gènes cibles (LaVoie and Selkoe 2003).

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Les KO de la préséniline ou son inhibition par des inhibiteurs de γ-sécrétase conduisent,

comme pour les KO des acteurs de la voie Notch (Rbpj, Hes) (Fukada, Yamaguchi et al. 2011;

Bjornson, Cheung et al. 2012; Mourikis, Gopalakrishnan et al. 2012), à une forte diminution

d’activation de la voie Notch. En effet, empêcher le clivage efficace du site S3 entraine une

diminution importante de la quantité intracellulaire de NICD clivé et par conséquent une

diminution d’activation des gènes cibles. Cependant, les souris Knock-in possédant un

récepteur NOTCH1 muté sur son site S3 (V1744G) présentent un phénotype hypomorphe

dans l’expression des gènes cibles de la voie Notch, montrant que le clivage du NICD est

certes moindre mais possible. En effet, il a été montré que le clivage du site S3 ne se faisait

pas uniquement entre les résidus G1743 et V1744 mais également à trois autres positions

situées plus en aval (entre les résidus 1744-1745 (site +1), 1745-1746 (site +2), 1746-1747

(site +3)) (Tagami, Okochi et al. 2008). Bien que le site S3 soit le site le plus efficacement

clivé par le complexe de la γ -secrétase, il semblerait que tous les sites le soient. Cependant,

il semblerait que seul le clivage entre les résidus G1743 et V1744 entraine la libération d’un

NICD stable, capable d’activer la voie Notch de manière efficace.

Dans le document Aspects biochimiques et cellulaires de la dérégulation du processus myogénique chez des souris hypomorphes pour le gène Pofut I (Page 144-150)