Cin´etique de croissance du biofilm

Dans cette section nous avons compar´e les courbes des cin´etiques de croissance du biofilm pour les deux contraintes de cisaillement impos´ees. Comme mentionn´e dans les textes pr´ec´edents, nous avons seulement quatre temps d’analyse pour chaque conditions hydrodynamique ´etudi´ee ( `a t=0, 24 h, 48 h et 72 h), ainsi cette analyse n’a pas pour but d´emontrer parfaitement le d´eveloppement du biofilm dans le temps, mais elle permet n´eanmoins de tirer des enseignements tr`es int´eressants concernant la tendance de la croissance.

Pour illustrer le biofilm form´e sous les conditions hydrodynamiques ´etudi´ee, les figures6.28.a et .b montrent des images des biofilms d´evelopp´es pendant 72 h sous le plus faible et fort cisaillement impos´e. On observe que le biofilm d´evelopp´e sous un plus fort cisaillement pr´esente un volume d’occupation plus ´elev´e que celui sous plus faible cisaillement.

Comme d´ej`a pr´esent´e dans les sections pr´ec´edentes, la zone externe du biofilm est plutˆot contrˆol´ee par des actions hydrodynamiques (´erosion et “sloughing”). Cette zone est ´egalement fortement influenc´ee par la croissance de la partie interne. Ainsi, dans cette premi`ere analyse de la cin´etique de croissance nous consid´erons uniquement la zone interne.

Dans cette section nous avons pris en compte les bact´eries vivantes et mortes. Pour cela, nous avons d’abord calcul´e la moyenne statistique de la fraction volumique sur toutes les positions analys´ees et ensuite nous avons trac´e le profil de la moyenne selon la hauteur (z). La valeur de H_int a ´et´e calcul´e sur le profil h ¯φi. Cette valeur est l´eg`erement diff´erente que ce qui est montr´e dans la tableau6.4mais reste du mˆeme ordre de grandeur. Pour l’exp´erience `a plus fort cisaillement nous avons consid´er´e la moyenne de la fraction volumique des deux jeux disponibles (exp´eriences A et B).

Nous avons trac´e dans la figure 6.29.a la variation de h ¯φ_inti en fonction du temps de d´eveloppement pour les deux conditions hydrodynamiques.

Nous observons que pour la partie plus dense du biofilm, les courbes pr´esentent la mˆeme allure pour les deux cisaillements impos´es. h ¯φ_inti augmente avec le temps, le profil est presque lin´eraire, sauf pour le biofilm d´evelopp´e avant 24 h. L’augmentation de h ¯φ_inti apparait plus vite pour le cas de fort cisaillement que le cas de faible cisaillement. Comme observ´e dans la section

6.4, la diff´erence peut ˆetre expliqu´ee par le fait que les ´etats initiaux (colonisation), autrement dit le nombre de bact´eries attach´ees, ne sont pas tous identiques d’une exp´erience `a autre. Cela peut indiquer une possible influence de l’´etat initial sur le biofilm d´evelopp´e jusqu’`a t = 24 h. Apr`es 24 h de d´eveloppement, le biofilm semble perdre la m´emoire des conditions initiales. Ainsi, nous pouvons comparer les exp´eriences les unes avec les autres, mˆeme si elles n’ont pas ´et´e r´ealis´ees en continu. Nous n’avons pas les informations `a propos du d´eveloppement jusqu’`a 24 h, donc on ne peut pas juger de la perte de m´emoire des conditions initiales dans cette phase de croissance. Ainsi, pour v´erifier l’´evolution du taux de croissance, nous avons consid´er´e les temps entre 24 h et 72 h (Fig. 6.29.b).

Si on cherche `a d´ecrire l’´evolution de h ¯φinti par un polynˆome d’ordre deux, on peut constater que les coefficients devant le terme au carr´e sont tr`es petits : on peut consid´erer que l’´evolution de h ¯φ_inti est bien lin´eaire (Fig. 6.29.b).

6.6. CIN ´ETIQUE DE CROISSANCE DU BIOFILM 125 x ② ③ µm (a) x y ❲ ❳ ❨ ⁰1 0 ➭❩ (b)

Figure 6.28 – Biofilm ˆag´e de 72 h : (a) Biofilm soumis `a une contrainte de cisaillement de 2.1 × 10−3 Pa (b) Biofilm soumis `a une contrainte de cisaillement de 9.4 × 10−2 Pa.

0 0.02 0.04 0.0❬ 0.0❭ 0.1 0.12 0 24 4❭ 72 ❪ ❫ ❫ ❴ ❵ ❜❝❞ ❢❝ ❣ ❤❥ ❦é❧❥ q♠ ♦♣♦❤✈①❥ ④ ④a❦⑤♦ ⑥⑦a⑤❧é✈❥♦④⑧❥ ⑨a❦❧♦④♦❧⑩ ①✈ ❧♦ ④ ❶❷ ❸ ❹❺ ) ❻❼ 2.4 x 10❽❾ Pa ❻❼ 9.4 x 10¯² Pa (a) ❿ = ➀7➁ ➀0➂x2 ➃ 0.0015x ➀0.0021 ➄² = 1 y = -1E-06x2+ 0.0011x + 0.0252 R² = 1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 24 48 72 Heures

Cinétique de Croissance - Bactéries Vivantes et Mortes (➅

int) ➆ = 2.4 x 10¯³ Pa ➆ = 9.4 x 10¯² Pa ➇ ii n t (b)

Figure 6.29 – Courbes de cin´etique de croissance pour la zone interne du biofilm (φ_int) pour les deux conditions hydrodynamiques employ´ees : τ_w= 2.1 × 10−3 Pa et τ_w = 9.4 × 10−2 Pa.

6.6. CIN ´ETIQUE DE CROISSANCE DU BIOFILM 127 En consid´erant le mod`ele de cin´etique de croissance pr´esent´e dans l’´etat d’art, l’´equation (6.12) permet d´ecrire la dynamique de la croissance bact´erienne :

dh ¯φ_inti

dt = (µ − b) h ¯φ_inti (6.12)

O`u h ¯φ_inti est la fraction volumique en biomasse suppos´ee proportionnelle au nombre de cellules ; µ le taux de croissance bact´erienne [h⁻¹], b le coefficient de mortalit´e [h⁻¹] et t est le temps [h].

Comme d´ecrit auparavant, les analyses r´ealis´ees pr´ec´edemment indiquent un possible proces-sus de comp´etition entre la croissance bact´erienne et une ´eventuelle quantit´e de biofilm d´etach´e sous l’action de l’´ecoulement pour les deux zones du biofilm analys´ees (interne et externe).

Pour cela, nous consid´erons qu’un terme se r´ef´erant au taux de d´etachement (K_d) ([h⁻¹]) intervient avec le taux de croissance pour le mod`ele de cin´etique de croissance. Pour la suite, l’ensemble des termes “µ - b - K_d” sera appel´e de µ_app (taux de croissance apparent) :

µ_app= µ − b − Kd=

dh ¯φinti dt

h ¯φ_inti ^(6.13)

En calculant la d´eriv´ee temporelle de h ¯φinti `a partir de l’´equation de r´egression obtenue pr´ec´edemment, il est possible d’obtenir le taux de croissance sp´ecifique apparent. Ainsi, la figure 6.30 et le tableau 6.5 pr´esentent des valeurs de (µ_app) pour la partie interne du biofilm pour les deux conditions hydrodynamiques employ´ees.

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 24 4➈ 72 ➉ a ➊ ➊ ➋ ➌ ➍ 1➎ He➏res Z➐➑e ➒➑ter➑e d➓ b➒➐ ➔ ➒→➣ 0 ↔↕↔ H ➙ ➛t ➜ = 2.4 x 10¯➝ Pa ➜➞ 9.4 x 10¯² Pa

Figure 6.30 – Evolution µ_app dans le temps pour la partie interne du biofim d´evelopp´e dans les deux conditions hydrodynamiques employ´ees : τw= 2.1 × 10⁻³ Pa et τw = 9.4 × 10⁻² Pa.

Temps de d´eveloppement du biofilm

Partie interne µapp [h⁻¹]

[h] τ_w = 2.1 × 10−3 Pa τ_w = 9.4 × 10−2 Pa 24 0.038 0.021 48 0.015 0.013 72 0.007 0.010

Table 6.5 – µ_app dans la partie interne du biofilm pour les deux conditions hydrodynamiques employ´ees : τw= 2.1 × 10⁻³ Pa et τw = 9.4 × 10⁻² Pa.

On constate que la valeur du taux de croissance apparent µ_apppour la zone interne du biofilm est largement inf´erieure `a celle obtenu dans la culture libre (0.85 h<sup>−1</sup>, tab.3.1 du chapitre 3). Cet ´ecart peut provenir des deux termes de la croissance µ<sub>app</sub> : le coefficient de mortalit´e et le taux de d´etachement. Comme indiqu´e dans la section 6.4, la fraction volumique des bact´eries mortes est tr`es inf´erieure `a celle des bact´eries vivantes (Fig. 6.14 et 6.15). De ce fait, nous pouvons ainsi consid´erer le terme b de l’´equation comme n´egligeable.

Ceci sugg`ere que le taux de croissance apparent est plutˆot influenc´e par le d´etachement, qui lui mˆeme est li´e au taux de cisaillement local.

Des auteurs tels que Melo & Bott (1997); Peyton & Characklis (1993); Bryers (1987);

Bakke et al.(1984);Rittman(1982) ont consid´er´e des expressions math´ematiques qui d´ecrivent une influence de l’´epaisseur du biofilm sur le taux de d´etachement. Ainsi, en supposant que µ_app prend en compte ´egalement le taux de d´etachement, nous avons ´egalement trac´e les courbes de la fraction volumique en fonction de µ_app pour les deux conditions hydrodynamiques impos´ees (Fig. 6.31) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0 0.02 0.04 0.0➟ 0.0➠ 0.1 0.12 ➡ a p p -1 <➢i➤t ➦➧2.4 x 10¯➨Pa ➦➧9.4 x 10¯² Pa Z➫➯e ➲➯ter➯e d➳ b➲ ➫➵➲➸➺ 0 ➻➼➻ H

Figure 6.31 – Evolution de µ_app avec φ_int pour les deux conditions hydrodynamiques em-ploy´ees : τ_w= 2.1 × 10−3 Pa et τ_w = 9.4 × 10−2 Pa.

in-6.7. CONCLUSION 129 tervalles observ´es. Cependant, on remarque sur la figure6.31que pour les diff´erentes conditions hydrodynamiques, les coefficients directeurs de la tendance lin´eaire des taux de croissance ap-parent sont tr`es diff´erents. Les exp´eriences `a plus faible cisaillement pr´esentent une d´ecroissance plus rapide de µ_app avec la fraction volumique par rapport `a l’exp´erience `a plus fort cisaille-ment. Comme montr´e dans le chapitre l’´etat d’art (section2.1.4), le milieu nutritif ou l’oxyg`ene peuvent ´eventuellement devenir un facteur limitant de la vitesse sp´ecifique de croissance. Le mod`ele le plus classiquement utilis´e qui prendre en compte cet effet est le mod`ele de Monod :

µ = µ_max i Y i=1 S_i KSi+ Si (6.14)

o`u S_i est la concentration du substrat i dans le milieu de culture, K_Si, la constante de saturation pour le substrat i, µ_max le taux de croissance maximum et µ le taux de croissance effectif.

Ainsi, la pente de la courbe plus prononc´ee pour les exp´eriences `a plus faible cisaillement peut indiquer une baisse de la disponibilit´e de milieu nutritif et d’oxyg`ene dans le biofilm, en engendrant une r´eduction de la diffusion et des r´eactions `a l’int´erieur du biofilm.

6.7 Conclusion

Grˆace `a la mise en œuvre de m´ethologies d’observation par microscopie confocale `a l’aide de marquage fluorescent et de protocoles d’analyses adapt´es aux diff´erentes ´echelles explor´ees depuis les tailles microm´etriques des bact´eries jusqu’aux ´echelles millim´etriques repr´esentatives de la matrice solide continue du biofilm, des informations nouvelles ont ´et´e apport´ees sur les m´ecanismes spatio-temporels de croissance de biofilms.

Pour cela il a ´et´e dans un premier temps n´ecessaire de d´efinir la valeur du coefficient de variation pour identifier l’aire ´el´ementaire repr´esentative des images permettant de caract´eriser correctement les propri´et´es de croissance du biofilm dans son ensemble. Les analyses ont mis en ´evidence qu’une surface correspondant `a 0.084 mm<sup>2</sup> est repr´esentative du biofilm pour le param`etre fraction volumique, soit quatre images de taille de 145.31µm × 145.31µm prises `a quatre positions diff´erentes. Ce r´esultat montre que le nombre d’images acquises au cours des exp´eriences pr´esent´ees, sont significatives de la structure du biofilm. Ainsi, la fraction volumique moyenne peut ˆetre consid´er´ee comme repr´esentative du biofilm.

Concernant l’´eventuelle influence des bact´eries adh´er´ees `a la partie sup´erieure de la chambre (en PDMS) sur les bact´eries adh´er´ees `a la lamelle en verre, nous constatons que les possibles d´eveloppements d’un biofilm sur le PDMS ne perturbent pas les conditions de croissance du biofilm sur la partie inf´erieure. Le milieu nutritif reste satur´e en nutriment `a cause du renouvelle-ment rapide du milieu `a l’´echelle locale par rapport `a l’´echelle caract´eristique de consommation par les bact´eries.

En analysant les profils de fraction volumique, nous observons que, quelles que soient les exp´eriences, une chute rapide de la fraction volumique se produit apr`es les premiers

d´eveloppements des couches du biofilm. Ainsi, nous avons d´ecid´e d’analyser le biofilm en dis-criminant deux zones diff´erentes : une zone interne plus dense et une zone externe moins dense constitu´ee d’une organisation filamenteuse.

Nous constatons que pour la partie dense du biofilm, les jeux de donn´ees A et B sont assez reproductibles. Pour la partie externe du biofilm, un plus grand ´ecart de la fraction volumique `

a t = 72 h est observ´e. Cette variation semble ˆetre corr´el´ee `a des effets hydrodynamiques sur la partie sup´erieure du biofilm (d´etachement).

Nous avons v´erifi´e la sensibilit´e de la formation du biofilm aux conditions initiales de colo-nisation en comparant la moyenne statistique de la fraction volumique des bact´eries vivantes pour les deux jeux de donn´ees `a plus fort cisaillement (les exp´eriences A et B). Les deux zones analys´ees semblent perdre la m´emoire des conditions initiales. Ainsi, cette perte de m´emoire des conditions initiales, conjointement au protocole rigoureux d’inoculations initiales des bact´eries, semble indiquer que les conditions d’ensemencement des chambres d’´ecoulement n’influencent pas la formation du biofilm.

En comparant les profils moyenn´es de la fraction volumique des bact´eries vivantes et mortes, une quantit´e largement plus importante des bact´eries vivantes est observ´ee, et ce quelle que soit l’exp´erience analys´ee.

En comparant les deux conditions hydrodynamiques impos´ees, nous percevons que les bio-films soumis `a un plus fort cisaillement pr´esentent un biofilm plus compact dans la zone interne. Nous observons ´egalement une densification de la zone interne du biofilm avec le temps pour les deux cisaillements impos´es.

En analysant la r´eparation spatiale du biofilm, nous constatons que d’une mani`ere g´en´erale, les biofilms form´es `a un plus fort cisaillement pr´esentent une plus grande h´et´erog´en´eit´e (partie interne et externe). Pour les deux conditions hydrodynamiques, une augmentation globale de la biomasse est per¸cue selon le temps d’observation pour la zone interne du biofilm, tandis qu’une r´eduction de la biomasse est constat´ee pour la zone externe `a t = 72 h (exp´erience `a plus faible cisaillement et exp´erience A `a plus forte cisaillement). Ces exp´eriences indiquent qu’un possible processus de d´etachement/´erosion apparaˆıt entre t = 48 h et t = 72 h avec une valeur critique de la fraction volumique sup´erieure aux valeurs mesur´ees `a t = 48 h. Nous observons ´egalement que la zone externe pr´esente une structure beaucoup plus h´et´erog`ene que celle de la zone interne, et ce quelle que soit la condition hydrodynamique impos´ee.

Nous nous sommes ´egalement int´eress´es `a la cin´etique de croissance du biofilm. Cependant, nous n’avons uniquement que quatre temps d’analyse. Ainsi, cette ´etude n’a pas pour but d’explorer pr´ecis´ement le d´eveloppement complet du biofilm. N´eanmoins, il permet d’apporter des tendances sur la croissance du biofilm. Pour cette ´etude, nous analysons uniquement la zone interne du biofilm.

Les courbes de l’´evolution de la fraction volumique dans le temps pour les deux conditions hydrodynamiques impos´ees pr´esentent la mˆeme allure. Cependant, nous ne pouvons pas affirmer de mani`ere pr´ecise la phase de d´eveloppement du biofilm puisque les temps d’observation sont tr`es courts. Ainsi, nous avons uniquement trois points de mesure du biofilm form´e.

Nous avons calcul´e un taux de croissance apparent pour chaque exp´erience. Ce taux de crois-sance apparent (µapp) comprend le taux de d´etachement, le taux de croissance et la mortalit´e du

6.7. CONCLUSION 131 biofilm. Nous percevons que les exp´eriences `a plus faible cisaillement pr´esentent une d´ecroissance plus rapide de µ<sub>app</sub> avec le temps et avec la fraction volumique par rapport `a l’exp´erience `a plus fort cisaillement. Nous observons ´egalement une pente de la courbe plus prononc´ee pour l’exp´erience `a plus faible cisaillement.

En analysant la loi de Monod, les travaux montrent que cette pente peut indiquer une baisse de la disponibilit´e de milieu nutritif et d’oxyg`ene dans le biofilm, en engendrant une r´eduction de la diffusion et r´eactions `a l’int´erieur du biofilm.

Chapitre 7

Conclusion

La motivation initiale de ce travail de recherche concerne l’optimisation de la biofiltration pour l’´epuration biologique d’effluents liquides car elle dispose de nombreux avantages par rap-port aux traitements `a culture libre, comme par exemple sa g´eom´etrie plus compacte et la r´eduction sur la production des sous-produits.

Afin d’optimiser le fonctionnement de ces syst`emes, il faut ´eviter un des obstacles majeurs `

a leur bon fonctionnement : leur colmatage rapide. Pour cela, il est n´ecessaire de maitriser la croissance des biofilms, notamment par le biais de l’influence de l’hydrodynamique sur leur formation et leur structure. Ainsi, il est essentiel de comprendre les effets de l’hydrodynamique sur les propri´et´es de croissance `a l’´echelle bact´erienne (´echelle locale).

Notre travail s’est ainsi focalis´e sur le d´eveloppement d’une m´ethologie compl`ete afin d’´etudier `a l’´echelle locale la croissance bact´erienne de Pseudomonas Putida sous l’effet d’´ecoulements cisaill´es.

Les conditions hydrodynamiques choisies correspondaient `a un nombre de Reynolds de l’ordre de 2 au maximum, ce qui correspond `a l’ordre de grandeur des Reynolds de pore typi-quement rencontr´es dans les applications vis´ees (Karrabi,2009).

Notre apport principal a ´et´e le d´eveloppement d’un protocole exp´erimental rigoureux et d’une m´ethodologie d’analyse permettant d’assurer le d´eveloppement du biofilm, la reproducti-bilit´e des essais effectu´es et une interpr´etation non biais´ee des r´esultats.

Pour cela, certaines d´emarches ont ´et´e mises en place en vue d’obtenir un protocole complet et syst´ematique `a chaque ´etape du d´eroulement des exp´eriences : (i) pr´eparation des cultures bact´eriennes et des syst`emes d’´ecoulement, (ii) croissance du biofilm sous hydrodynamique contrˆol´ee, (iii) observation du biofilm sous microscope confocal au moyen de fluorochromes et (iv) traitement d’images.

(i) Pr´eparation des cultures bact´eriennes et syst`emes d’´ecoulement

Pour assurer que l’´etat m´etabolique des bact´eries utilis´ees dans les exp´eriences soit le plus stable possible, nous avons modifi´e le protocole standard utilis´e jusque-l`a.

En particulier, (i) nous ´evitons la d´econg´elation de la culture stock pour effectuer le pr´el`evement bact´erien permettant la pr´eparation de la culture bact´erienne solide (en milieu LA) qui servira `a l’inoculation des pr´e-cultures, et (ii) cette culture bact´erienne solide n’est pas conserv´ee pour ˆetre r´eutilis´ee, mais une nouvelle culture est pr´epar´ee syst´ematiquement `a

chaque fois qu’une pr´e-culture est n´ecessaire. Cette derni`ere proc´edure minimise aussi certains risques de contamination. De mˆeme, pour ´eviter des effets de shift-down (passage d’un milieu riche `a un milieu pauvre) et un stress bact´erien, le milieu LB modifi´e sans peptone a ´et´e utilis´e quelles que soient les ´etapes au cours des exp´eriences (pr´e-culture, croissance du biofilm).

(ii) Croissance du biofilm sous hydrodynamique contrˆol´ee

Des d´eveloppements sp´ecifiques ont ´et´e r´ealis´es pour la formation et l’observation du biofilm : syst`eme d’alimentation gravitaire `a pression constante et chambres d’´ecoulement (Chambre en PMMA modifi´e et PDMS).

Des chambres d’´ecoulement ont ´et´e con¸cues afin de pouvoir d´evelopper un biofilm sous conditions hydrodynamiques contrˆol´ees et permettre son observation sous microscope confocal. Ce nouveau design permet d’avoir une chambre plus stable sur la platine du microscope et ainsi d’obtenir des images sans d´ecalage du plan focal. Les chambres en PDMS ont ´et´e aussi con¸cues pour pallier l’existence de contaminations sur la chambre PMMA (chambre non jetable). Une autre caract´eristique de ces chambres est leur taille, avec une surface suffisamment grande pour garantir l’observation de la structure du biofilm sur une surface repr´esentative, avec l’existence d’une zone d’observation `a cisaillement contrˆol´e et uniforme. La validation des champs de vitesse dans ces deux chambres d’´ecoulement a ´et´e r´ealis´ee en comparant le r´esultat th´eorique avec les r´esultats de simulations num´eriques. Cette analyse montre que sur la zone d’observation (zone maximale : 18 × 12 mm² situ´e au milieu de chambre) de l’´ecoulement est bien de type laminaire 2D, avec un profil de vitesse parabolique (poiseuille), invariant selon le plan (x ; y).

(iii) Observation du biofilm sous microscope au moyen de fluorochromes

Des tests ont ´et´e effectu´es afin de d´eterminer les marqueurs fluorescents `a mettre en œuvre et leurs conditions d’utilisation pour l’observation du biofilm developp´e. Deux marqueurs des EPS ont ´et´e test´es : ConcTetra et Conc647. Nous avons rencontr´e 3 difficult´es majeures pour l’observation des EPS avec ces marqueurs : (1) la formation d’agr´egats fluorescents, (2) l’identi-fication du marquage des fluorochromes (sans rep`ere comparatif sous lumi`ere transmise) et (3) l’ajustement de la puissance du laser.

De ce fait, dans la suite du travail nous n’avons pas pu poursuivre l’objectif de l’observation des EPS. Les essais exp´erimentaux de ce travail de th`ese se sont focalis´es sur l’observation des bact´eries vivantes (fluorochrome Syto9) et mortes (fluorochrome PI) `a une concentration de 2.0 ml(Syto9 ou PI)/L.

(iv) Traitement d’images

Des outils de traitement et d’analyse d’image ont ´et´e mis en place en utilisant des biblioth`eques de fonctions existantes (boite `a outil de Matlab d´edi´ee au traitement d’images num´eriques), avec une attention particuli`ere sur le choix des traitements r´ealis´es et leur s´equencement. Les ´etapes du traitement des images sont : formation et num´erisation de l’image (sur microscope confocal), pr´e-traitement (Filtres“imbothat” et “imtophat”), segmentation (calcul du gradient : Filtre Sigma ; calcul du seuil : M´ethode d’Otsu), post-traitement (ouverture morphologique) et analyse de l’image (surface occup´ee et nombre de bact´eries).

135 Cependant la proc´edure de traitement pr´esent´ee n’est que semi-automatique. Selon la