Cinétique d’élimination des biofilms de Pseudomonas fluorescens

V.1.1. Phase de contamination des équipements Contamination en condition semi!statique.

Au préalable, une suspension mère est préparée dans 50 ml de TSB après prélèvement de colonies à partir de boîtes de pétri contenant du milieu nutritif gélosé TSA (Trypton Soy Agar) et incubation une nuit à 30 °C. Cette culture est alors diluée dans du lait écrémé (1/10) de façon à obtenir une suspension bactérienne à 105 _{UFC ml}-1_{. Les biofilms}

sont formés dans les conduites cylindriques en acier inoxydable décrites précédemment après remplissage au laboratoire par la suspension de P. fluorescens. Les tubulures sont au préalable associées 3 par 3. Une première incubation de 24h à 20°C permet à la fois l’adhésion des cellules et la croissance de biofilm en surface. Placés sur le tourniquet et maintenus à 20°C, l’incubation dure dans cette première étape 24h. Après 24 h, les

contaminé (dilué au dixième également). Ils sont remis en rotation pendant 24 h supplémentaires. Cette étape est considérée comme un apport de nutriment. La contamination en condition semi-statique, si elle est représentative des cuves de stockage, des coudes, des zones à faible circulation en industrie agro-alimentaire, permet aussi et surtout d’avoir une contamination homogène des surfaces et ainsi de s’affranchir des conséquences que pourrait engendrer un écoulement lors d’un cycle de contamination. Dans le but de pouvoir visualiser le biofilm avant et après le nettoyage des surfaces en acier inoxydable, des coupons ont aussi été utilisés. Le biofilm est formé dans des conditions identiques à celles décrites ci-dessus. Dans ce mode de formation, les coupons stériles sont placés dans des boîtes de Pétri pour être ensuite recouverts de la suspension encrassante. Les boites contenant les coupons encrassés sont mise à 20°C, pendant 24h sans agitation. Après ce temps de contact, un renouvellement du milieu encrassant est effectué par du lait stérile dilué au dixième. Les boîtes sont laissées 24 h supplémentaires pour permettre le développement du biofilm. A 48 h de formation, les coupons sont sortis de la suspension d’encrassement et rincé dans de l’eau ultra pure pour éliminer toutes traces de lait et aussi les bactéries mal adhérées. Nous n’avons pas choisi de mettre directement les coupons dans les tubes supports et de les positionner dans le tourniquet. En effet la géométrie particulière des tubes support des coupons aurait entraîné des artéfacts quand à la l’organisation du biofilm plus dommageable pour notre étude que le choix qui a été fait avec une croissance du biofilm en conditions complètement statiques.

Formation du biofilm mixte à P. fluorescens et à B. cereus 98/4.

Afin de s’affranchir d’un mélange lait-TSB (1/10), nous avons choisi de ne former le biofilm mixte que dans du TSB (1/10). Le mode de croissance du biofilm est identique à toutes les études réalisées auparavant. Au préalable, une suspension mère pour chaque souche bactériennes est préparée dans 50 ml de TSB après prélèvement de colonies à partir de boites de Pétri contenant du milieu nutritif gélosé TSA (Trypton Soy Agar) et incubation une nuit à 30 °C. Cette culture est alors diluée dans du TSB de façon à obtenir une densité optique de 0.01 pour Pseudomonas et de 0.02 pour Bacillus à 550 nm. Le mélange des deux souches se fait dans un tube conique stérile de 50 ml. Nous utilisons 2 volumes de B. cereus et 1 volume de Pseudomonas.

La formation du biofilm se fait en 48 h avec un renouvellement de milieu après deux heures d’adhésion dans du TSB (1/10). Après les 48 h de formation, les coupons sont rincés par immersion dans de l’eau ultra pure pour éliminer toutes traces de TSB mais aussi, les bactéries mal adhérées. Comme décrit précédemment lors de l’étude réalisée avec les biofilms mono-espèces de Bacillus, trois coupons sont analysés dont deux pour la quantification de la contamination et un coupon pour l’imagerie à epifluorescence.

V.1.2. Phase de nettoyage/rinçage du biofilm de Pseudomonas

fluorescens

Trempage

Cet essai a été réalisé avec les tubes droits cylindriques. La procédure de trempage commence par un pré-rinçage des tubes par immersion dans de l’eau adoucie à température ambiante pour éliminer les bactéries ne faisant pas partie du biofilm et le lait. Un tube est conservé pour identifier la contamination initiale. Les autres tubes sont ensuite remplis un à un par de l’eau osmosée préalablement chauffée a 40°C et fermés par des opercules puis le tout est plongé dans un bain-marie préchauffé à 40°C. Les tubes sont ensuite prélevés régulièrement pour visualiser un éventuel décrochement lié au trempage et rincé par un nouveau trempage rapide dans de l’eau osmosée à température ambiante. Les temps choisis sont ceux que nous utilisons pour l’ensemble des cinétiques à savoir, 1, 3, 5, 10, 15, 20 et 30 min.

Nettoyage en conditions statique en présence de soude.

Cette étude a nécessité l’utilisation de plusieurs concentrations de NaOH (0,1% ; 0,35% ; 0,45%, 0,5%, 0,60%) pour une température de 60°C. Dans cette procédure de nettoyage, toutes les étapes sont identiques à la procédure de trempage décrite précédemment. Chaque tube après trempage dans la soude pour un temps donné est rincé comme décrit précédemment par trempage rapide dans de l’eau osmosée à température ambiante.

Rinçage et nettoyage en conditions dynamiques.

Cette expérimentation se déroule sur la plate-forme pilote. L’exécution du programme du NEP est entièrement automatisé pour s’affranchir de toutes variations possibles en mode manuel.

Pour les cinétiques de rinçage, 4 contraintes de cisaillements pariétaux ont été testées (0,144 Pa, 1,56 Pa, 4,506 Pa et 20 Pa). (calcul des contraintes annexes 7)

Pour la cinétique de nettoyage type NEP classique, nous avons choisi une contrainte pariétale moyenne de 0,144 Pa et une concentration en soude de 0,5%.

Dans chacune des conditions balayées, 4 essais ont été réalisés. Le programme de rinçage/nettoyage se déroule comme suit :

i. Pré-rinçage de 3 min sans recirculation à température ambiante à l'eau adoucie à 300 l h-1

(moyenne de vitesse de 0,20 ms-1_{, nombre de Reynolds (Re) = 4740),}

ii. Rinçage/nettoyage pour les durées suivantes, 1, 3, 5, 10, 15, 20 et 30 min,

iii. Rinçage final sans recirculation de 3 min. Les tubes témoin de contamination subissent d'abord un rinçage à l'eau adoucie à 300 l h-1 _{(moyenne de vitesse de 0,20 ms.}-1_{, nombre de Reynolds (Re) =}

4740) à la température ambiante pendant 3 min sans aucune recirculation.

Comme précédemment, les tubes témoins de contamination simplement trempés dans de l’eau osmosée permettent d’identifier le niveau initial de contamination.

Après chaque temps de cinétique, les trois tubes testés ensembles sont démontés, bouchonnés avec du papier aluminium, puis mis à égoutter. Les tubes sont par la suite transportés au laboratoire afin de quantifier la contamination résiduelle.

En conditions dynamique avec les coupons (0,144 Pa en tubes carrés)

Cette étude est réalisée avec les tubulures support pour coupons (tubes à section rectangulaire). L’objectif est de pouvoir observer via la microscopie, l’évolution des biofilms à l’issue de chacun des temps de cinétique ce qu’il est délicat d’envisager dans les tubulures en acier inoxydable. La procédure se déroule comme précédemment sur la boucle d’essai pilote. Cinq coupons sont ainsi insérés par tubes. Comme nous l’avons signalé précédemment, seuls les 3 coupons du centre sont analysés : 2 servent à quantifier le biofilm résiduel et le troisième sert à l’observation sous microscope (MEB ou à épiflurescence).