Cinétique de l'activation des ERK-1/

Pour évaluer de façon directe l'activation des ERK-1/2 par l'uPA et la plasmine, une cinétique de la phosphorylation des ERK-1/2 a été réalisée. L'uPA (10 nM) induit une phosphorylation des ERK-1/2 à 2 minutes 30 secondes. L'effet de la plasmine est beaucoup plus variable : sur l'image présentée ici, aucune phosphorylation n'est observée. Des cinétiques de la phosphorylation des ERK-1/2 ont été effectuées auparavant selon la méthode A. Elles ne sont pas présentées ici puisque l'anticorps était différent et que les films sont surexposés. Par contre, ces résultats préliminaires (n = 2) suggéraient une phosphorylation des ERK-1/2 à des temps variant entre 5 et 15 minutes. Il est donc possible que la plasmine possède, elle aussi, la capacité d'activer les ERK-1/2. Par contre, jusqu'à maintenant, elle est difficile à confirmer puisque la phosphorylation n'est pas apparu au même moment d'une expérience à l'autre, soit entre 2,5 minutes à plus de 15 minutes. D'autres expériences seront nécessaires pour confirmer l'activation des ERK-1/2 par la plasmine à un moment précis.

ERK-p ERK total

Temps (min) 0 1 2,5 5 7,5 10 15 0 1 2,5 5 7,5 10 15 uPA

(10 nM) plasmine _{(1 nM)}

Figure 15. Activation des ERK-1/2 par l'uPA et la plasmine. Les éosinophiles furent incubés avec de l'uPA (10 nM) ou de la plasmine (1 nM) pendant 0, 1, 2,5, 5, 7,5, 10 et 15 minutes. Les photos représentent des immunobuvardages des ERK-1/2 phosphorylés et totaux (42 et 44 kDa), n = 1.

45

Chapitre V : Discussion

La MMP-9 est une protease de premier plan impliquée dans la migration de l'éosinophile. Elle est nécessaire à la dégradation de la membrane basale des vaisseaux sanguins et de la matrice extracellulaire lors de ce phénomène. Sa sécrétion est stimulée par différents médiateurs tels le C5a, le TNF-a, le PAF et le 5-oxo-ETE [53,71,72,73]. Jusqu'à maintenant, aucune étude n'a démontré l'implication d'autres proteases dans le phénomène de sécrétion de la MMP-9 chez l'éosinophile. Depuis plusieurs années, le Dr Laviolette et son équipe s'intéressent aux proteases impliquées dans la migration de l'éosinophile [53,89]. Dans une étude publiée en 2008, qui traite des voies signalétiques impliquées dans la migration de l'éosinophile, ils suggèrent que la voie des ERK-1/2 serait impliquée dans la sécrétion de la MMP-9 à long terme via le système plasminogène/plasmine [64]. Dans l'étude présente, nous nous sommes donc intéressés à comprendre le rôle du système plasminogène/plasmine dans la sécrétion de la MMP-9. Deux proteases de ce système furent sélectionnées; l'uPA et la plasmine. En effet, nous avons démontré qu'il est possible pour l'uPA et la plasmine d'induire une sécrétion de MMP-9.

Pour ce qui est de l'uPA, son effet maximal se produit à des concentrations semblables pour les deux méthodes utilisées, soit 20 nM pour la méthode A et 10 nM pour la méthode B; seule la sécrétion induite selon la méthode B s'est révélée significative. De plus, une étude de Menshikov et coll. publiée en 2006 a démontré un effet similaire de l'uPA chez les monocytes THP-1 [85]. Des monocytes ont été placés en présence d'uPA à des concentrations entre 20 et 200 nM et la sécrétion de MMP-9 dans le surnageant a ensuite été analysée par zymographie. Ils ont ainsi observé une augmentation de la sécrétion de la MMP-9. Cette étude est d'autant plus intéressante puisqu'elle démontre également que cette augmentation est directement reliée à la liaison de l'uPA à son récepteur et non à son activité catalytique. Des expériences supplémentaires devront être effectuées pour évaluer si, dans notre modèle, cette liaison est aussi importante.

Pour la plasmine, la sécrétion maximale de la MMP-9 se produit à 20 nM pour la méthode A et 1 nM pour la méthode B. D y a donc discordance en ce qui a trait aux

46 concentrations entre les deux méthodes. De plus, même si l'induction de la sécrétion de la MMP-9 semble toujours présente, elle n'est jamais significative. Par contre, quelques études ont décrit un rôle de la plasmine dans la sécrétion de MMPs. Dans celle de Zhang et coll., la plasmine induit la sécrétion de la MMP-1 chez le monocyte via un récepteur, l'annexine II [90]. La plasmine possède donc la capacité d'induire la sécrétion de MMPs chez certains leucocytes. Nous avons également pu observer qu'à une concentration de 100 nM, la MMP-9 se retrouve sous le niveau du contrôle (Figure 13, A), ce qui suggère que plus la concentration de la plasmine est élevée, moins la quantité de MMP-9 est importante. Mazzieri et coll. ont démontré que la plasmine en solution aqueuse dégrade les deux gélatinases. Ainsi, la plasmine induit probablement une sécrétion de MMP-9 plus importante que ce qui nous est possible de voir, car une partie de cette MMP-9 pourrait être dégradée dans le milieu avant que l'incubation ne soit terminée. De ce fait, plus la concentration est élevée, plus la dégradation est importante, ce qui pourrait probablement expliquer la faible quantité de MMP-9 retrouvée en présence de 100 nM de plasmine.

Afin de vérifier si la sécrétion de la MMP-9 se produisait à court ou à long terme, une cinétique a tout d'abord été effectuée selon la méthode A. L'analyse de ces cinétiques a révélé que la sécrétion de la MMP-9, induite autant par l'uPA que la plasmine, se produit majoritairement entre 9 et 15 heures, 15 heures étant le temps où la sécrétion est maximale. De plus, une diminution est observée à 18 heures. À ce moment, l'éosinophile ne doit plus sécréter de MMP-9 et celle-ci doit commencer à se dégrader dans le milieu. L'uPA et la plasmine sont donc belles et bien impliquées dans une sécrétion de MMP-9 qui ne semble pas impliquer le relarguage de la MMP-9 préformée et stockée dans les granules de l'éosinophile, mais la synthèse de novo de cette protease. D est possible que l'uPA et la plasmine activent la transcription de la MMP-9 qui sera ensuite traduite et sécrétée. Grâce à ces cinétiques, nous nous sommes également aperçus que nous n'utilisions pas le temps optimal pour détecter le maximum de MMP-9. C'est pour cette raison que nous avons modifié le temps d'incubation pour la méthode B. La même cinétique a ensuite été effectuée selon la méthode B pour vérifier que le temps de sécrétion maximale n'était pas modifié par la nouvelle méthode. Cette cinétique nous a montré que le temps optimal était toujours de 15 heures.

47

L'objectif visé par la mise au point d'une nouvelle méthode (la méthode B) était non seulement de rectifier les temps d'incubation, mais d'éviter toute variabilité possible entre les résultats qui auraient pu être imputés aux petits volumes utilisés lors des incubations et des immunobuvardages. En travaillant à 106cellules/ml, au lieu de IO7

cellules/ml, les volumes pouvaient être 10 fois plus grands. De plus, les tubes Eppendorf à fond conique ont été remplacés par une plaque 24 puits. La dispersion des cellules se fait différemment dans les deux méthodes. En tube, les éosinophiles, en descendant par gravité au fond, forment un culot dense. Les cellules sont ainsi très proches les unes des autres. Par contre, en plaque, les cellules sont beaucoup plus dispersées. Les cellules sont en contact, mais beaucoup moins que dans le premier modèle. Le second modèle est donc probablement plus représentatif de ce qui se produit in vivo. De plus, la plus grande dispersion permet probablement une exposition plus importante des cellules aux différents stimuli.

Quelques différences ont été relevées entre les résultats obtenus selon les deux méthodes. L'uPA, même si son effet est optimal à des concentrations similaires dans les deux méthodes, induit une sécrétion de MMP-9 plus importante et statistiquement significative seulement avec la méthode B. Ces différences s'expliquent entre autres par le fait que le temps d'incubation utilisé pour la méthode B était de 15 heures, le temps optimal de sécrétion. Avec la plasmine, la sécrétion de MMP-9 est toujours plus variable, peu importe la méthode. De plus, les concentrations de plasmine induisant la sécrétion optimale de MMP-9 varient beaucoup entre les deux méthodes, soit 20 nM pour la méthode A et de 1 nM pour la méthode B. Pour l'instant, nos résultats ne nous permettent pas d'expliquer en profondeur les causes possibles de ce changement. Par contre, dans les études discutées ci- haut où la sécrétion de MMPs est induite par l'uPA ou la plasmine, l'activité catalytique de ces proteases n'est pas mise en cause, mais la présence de la membrane plasmique est nécessaire pour que l'effet puisse être observé [85,90]. Dans de telles circonstances, le fait que les cellules plus dispersées aient besoin d'une concentration moins élevée de plasmine se justifierait probablement par le fait que les membranes cellulaires sont plus exposées, donc plus disponibles pour une éventuelle liaison. De plus, comme il n'y a pas de culot, la MMP-9 sécrétée doit être exposée plus rapidement à la plasmine qui, en solution dans le

48 milieu, la dégrade. Bien sûr, il ne s'agit que d'une hypothèse qui pourrait expliquer la discordance entre les deux méthodes. Des expériences complémentaires devraient être effectuées afin de pouvoir vérifier cette hypothèse.

Dans l'étude du Dr. Laviolette citée plus haut, on suggérait l'implication des ERK-1/2 dans la sécrétion de la MMP-9 induite par le système plasminogène/plasmine [64]. Dans les études de Menshikov et coli et de Zhang et coll., discutées précédemment, la voie des ERK-1/2 était également impliquée dans la sécrétion des différentes MMPs [85,90]. Nous nous sommes donc intéressés à cette voie dans notre étude. Dans un premier temps, nous avons utilisé un inhibiteur de la voie des ERK-1/2, le PD 98059. Tout comme dans les études de nos confrères [85,90], cet inhibiteur a prévenu la sécrétion de la MMP-9 induite autant par la plasmine que par l'uPA. Nous avons ensuite voulu démontrer une activation plus directe de la voie des ERK-1/2 par l'uPA et la plasmine. Une cinétique de la phosphorylation des ERK-1/2 a donc été effectuée. L'activation des ERK-1/2 s'est révélée positive pour l'uPA, mais pas pour la plasmine. Cependant, cette expérience devra être effectuée avec plusieurs autres sujets avant de pouvoir tirer des conclusions, car les résultats préliminaires démontrent que la plasmine pouvait, elle aussi, induire l'activation des ERK-1/2. Ces résultats préliminaires montrent que l'activation des ERK-1/2 par la plasmine varie beaucoup dans le temps, soit entre 5 et 15 minutes. Le fait que les temps de phosphorylation changent beaucoup d'une cinétique à l'autre pourrait expliquer pourquoi l'activation n'est pas détectée dans la cinétique présentée ci-haut. L'activation aurait peut-être pu être détectée à des temps différents que ceux utilisés pour la cinétique. La variation observée entre les temps d'activation nous a ensuite poussée à nous questionner sur la possible présence d'un intermédiaire. La plasmine pourrait activer un autre médiateur qui lierait un récepteur et activerait ERK-1/2 et conséquemment, induirait la sécrétion de la MMP-9. À la lumière de ces résultats, il semble très probable que la voie signalétique des ERK-1/ 2 soit impliquée dans la sécrétion de la MMP-9 induite par l'uPA. En ce qui a trait à la plasmine, d'autres expériences doivent être effectuées avant de pouvoir conclure.

49 L'IL-5 est nécessaire à l'éosinopoïèse et à l'activation de l'éosinophile. Notamment, pour que le PAF puisse induire une migration, l'IL-5 doit être présente [91]. De plus, elle augmente la migration de l'éosinophile induite par le 5-oxo-ETE. En plus d'augmenter la migration, l'IL-5 est ajoutée afin de promouvoir la survie de l'éosinophile, puisque hors du corps humain, il ne survit que quelques heures seulement. Sans l'IL-5, les éosinophiles, après des incubations de 15 ou de 18 heures, ont une viabilité de 80%. Cela représente une baisse de près de 20 %, puisqu'en présence d'IL-5 la viabilité est d'environ 98%. Comme l'IL-5 est nécessaire pour différentes fonctions de l'éosinophile et que sa présence lors des incubations est obligatoire, nous nous sommes intéressés au rôle de cette cytokine dans notre modèle de sécrétion de MMP-9. Des incubations avec et sans IL-5 ont été effectuées et comparées. Les analyses par immunobuvardages ont démontré que sans IL-5, il ne se produisait aucune modulation de la sécrétion de la MMP-9. Comme la survie de l'éosinophile est affectée dans les conditions sans IL-5, nous ne nous attendions pas à des taux de sécrétion aussi fort qu'en présence d'IL-5. Par contre, avec 80% de cellules viables, s'il y avait une modulation, elle aurait été détectée. L'IL-5 est donc nécessaire à l'éosinophile pour que le 5-oxo-ETE, l'uPA, la plasmine et le PD 98059 puissent moduler la sécrétion de la MMP-9. L'IL-5 active plusieurs voies signalétiques, telles les JAK-STAT et les MAP kinases [92]. Étant donné que la voie des ERK-1/2 peut être impliquée dans cette activation, nous avons voulu nous assurer que les diminutions de la MMP-9 induites par PD 98059 sont dues à une activation de la voie des ERK-1/2 par l'uPA et la plasmine et non une activation via l'IL-5. Des éosinophiles furent incubés avec de l'IL-5, avec ou sans PD 98059. Après analyse, aucune différence dans les quantités de MMP-9 n'est apparue entre les deux conditions d'incubation. Les diminutions de la MMP-9 observées en présence de PD 98059 sont donc belles et bien dues à l'action des deux proteases sériques.

Ces résultats nous nous permettent d'affirmer que l'uPA induit une sécrétion de la MMP-9 et que la voie des ERK-1/2 est très probablement impliquée dans ce processus. Ils suggèrent également que la plasmine pourrait avoir un rôle à jouer dans la sécrétion de la MMP-9. Par contre, ils ne permettent pas de savoir si les effets observés sont dus à la liaison de l'uPA à l'uPAR, ou de la plasmine à l'annexine II ou l'a-énolase. Ils ne permettent pas non plus de savoir si l'activité catalytique de l'uPA et de la plasmine sont

50

nécessaires à l'activation de la sécrétion de la MMP-9. Des expériences supplémentaires devront être effectuées afin de déterminer de quelle façon la sécrétion de la MMP-9 est induite. Dans leur étude, Menshikov et coll. ont démontré que la sécrétion de la MMP-9 était due à la liaison de l'uPA à son récepteur en utilisant des sous-unités de l'uPA [85]. Au lieu d'incuber leurs monocytes avec de l'uPA entier, ils ont utilisé des molécules contenant soit le domaine catalytique soit les domaines de liaison au récepteur. Ils ont ainsi démontré que la molécule dont le domaine catalytique a été retiré est aussi efficace que la molécule complète pour induire la sécétion de la MMP-9. L'utilisation de sous-unités de l'uPA dans notre modèle pourrait être une bonne façon de déterminer si c'est l'activité catalytique ou la liaison de la portion ATF à l'uPAR qui est responsable de la sécrétion de la MMP-9 chez l'éosinophile. L'utilisation d'anticorps bloquants anti-uPAR ou d'une PI-PLC pourrait également nous révéler si l'uPAR est impliqué cette sécrétion de MMP-9. Pour ce qui est de l'annexine II et de l'a-énolase, les deux récepteurs potentiels de la plasmine, ils n'ont pas été décrits chez l'éosinophile jusqu'à maintenant. B serait donc intéressant de déterminer s'ils sont exprimés par l'éosinophile et, s'il y a lieu, de décrire leur rôle dans ce phénomène.

51

Conclusion

Cette étude a permis de mieux comprendre le rôle des proteases dans la migration de l'éosinophile. Les proteases n'agissent pas seulement en dégradant des protéines de la MEC, elles peuvent également agir directement sur la cellule. Nous avons démontré que le système plasminogène/plasmine est impliqué dans la sécrétion de la MMP-9 en montrant que l'uPA induit la sécrétion de la MMP-9. Nous avons également montré que cette sécrétion est maximale à 15 heures. De plus, nous avons démontré que la voie des ERK-1/2 est impliquée dans cette sécrétion de la MMP-9 induite par l'uPA. Par contre, il est impossible de conclure en ce qui a trait à la plasmine, les résultats ne sont pas assez reproductibles. D'autres expériences devront être effectuées afin de mieux comprendre le mécanisme par lequel le système plasminogène/plasmine contribue à l'augmentation de la sécrétion de la MMP-9.

Bibliographie

1. Benayoun L, Pretolani M. Le remodelage bronchique dans l'asthme : mécanismes et enjeux thérapeutiques. Médecine science, 2003.19:319-26.

2. Dubé J, Boulet LP. Rôles de l'inflammation et des modifications des structures bronchiques dans l'asthme allergique. Médecine science, 1996.12:351-7.

3. Tillie-Leblond I, Uiescu C, Deschildre A. [Physiopathology of inflammatory events in asthma]. Arch Pediatr, 2004.11 Suppl 2:58s-64s.

4. Chen, Y., Johansen, H., Thillaiampalam, S., and Sambell, C. Asthma. 2003. http://www.statcan.ac.ca/studies-etudes/82-003/arcriive/2005/7790-ena.pdf

5. Bernstein DI. ABCs of Asthma. Clin Cornerstone, 2008.8:9-25.

6. Barnes PJ. How corticosteroids control inflammation: Quintiles Prize Lecture 2005. Br J Pharmacol, 2006.148:245-54.

7. Barnes PJ, Chung KF, Page CP. Inflammatory mediators of asthma: an update. Pharmacol Rev, 1998.50:515-96.

8. Barnes PJ. New therapies for asthma. Trends Mol Med, 2006.12:515-20.

9. Cox G, Thomson NC, Rubin AS, Niven RM, Corris PA, Siersted HC et al. Asthma control during the year after bronchial thermoplasty. N Engl J Med, 2007.356:1327- 37.

10. Bousquet J, Chanez P, Lacoste J Y, White R, Vic P, Godard P et al. Asthma: a disease remodeling the airways. Allergy, 1992.47:3-11.

11. Davies DE, Wicks J, Powell RM, Puddicombe SM, Holgate ST. Airway remodeling in asthma: new insights. J Allergy Clin Immunol, 2003.111:215-25.

12. Bousquet J, Yssel H, Vignola AM. Is allergic asthma associated with delayed fetal maturation or the persistence of conserved fetal genes? Allergy, 2000.55:1194-7. 13. Holgate ST, Davies DE, Lackie PM, Wilson SJ, Puddicombe SM, Lordan JL.

Epithelial-mesenchymal interactions in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol, 2000.105:193-204.

53 14. Holgate ST. Pathogenesis of asthma. Clin Exp Allergy, 2008.38:872-97.

15. Goldsmith AM, Bentley JK, Zhou L, Jia Y, Bitar KN, Fingar DC et al. Transforming growth factor-beta induces airway smooth muscle hypertrophy. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006.34:247-54.

16. Chen G, Khalil N. TGF-betal increases proliferation of airway smooth muscle cells by phosphorylation of map kinases. Respir Res, 2006.7:2.

17. Bosse Y, Thompson C, Stankova J, Rola-Pleszczynski M. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor betal synergism in human bronchial smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006.34:746-53.

18. Roche WR, Beasley R, Williams JH, Holgate ST. Subepithelial fibrosis in the bronchi of asthmatics. Lancet, 1989.1:520-4.

19. Brewster CE, Howarth PH, Djukanovic R, Wilson J, Holgate ST, Roche WR.

Myofibroblasts and subepithelial fibrosis in bronchial asthma. Am J Respir Cell Mol Biol, 1990.3:507-11.

20. Gizycki MJ, Adelroth E, Rogers AV, O'Byrne PM, Jeffery PK. Myofibroblast

involvement in the allergen-induced late response in mild atopic asthma. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997.16:664-73.

21. Sun G, Stacey MA, Bellini A, Marini M, Mattoli S. Endothelin-1 induces bronchial myofibroblast differentiation. Peptides, 1997.18:1449-51.

22. Constantino GT, Mello JF, Jr. Remodeling of the lower and upper airways. Braz J Otorhinolaryngol, 2009.75:151-6.

23. Diehl S, Rincon M. The two faces of IL-6 on Thl/Th2 differentiation. Mol Immunol, 2002.39:531-6.

24. O'Byrne PM, Dolovich J, Hargreave FE. Late asthmatic responses. Am Rev Respir Dis, 1987.136:740-51.

25. Bradding P, Holgate ST. Immunopathology and human mast cell cytokines. Crit Rev Oncol Hematol, 1999.31:119-33.

26. Marshall JS. Mast-cell responses to pathogens. Nat Rev Immunol, 2004.4:787-99. 27. Bradding P, Holgate ST. Immunopathology and human mast cell cytokines. Crit Rev

54

28. Peters-Golden M. The alveolar macrophage: the forgotten cell in asthma. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004.31:3-7.

29. Lohmann-Matthes ML, Steinmuller C, Franke-Ullmann G. Pulmonary macrophages. Eur Respir J, 1994.7:1678-89.

30. Careau E, Bissonnette EY. Adoptive transfer of alveolar macrophages abrogates bronchial hyperresponsiveness. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004.31:22-7.

31. Tang C, Inman MD, van Rooijen N, Yang P, Shen H, Matsumoto K et al. Th type 1- stimulating activity of lung macrophages inhibits Th2-mediated allergic airway inflammation by an IFN-gamma-dependent mechanism. J Immunol, 2001.166:1471- 81.

32. Larche M, Robinson DS, Kay AB. The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol, 2003.111:450-63.

33. Del Prête GF, de Carli M, D'Elios MM, Maestrelli P, Ricci M, Fabbri L et al. Allergen exposure induces the activation of allergen-specific Th.2 cells in the airway mucosa of patients with allergic respiratory disorders. Eur J Immunol, 1993.23:1445-