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O sangue humano foi obtido de doadores saudáveis, que assinaram consentimentos formais para este estudo. Todas as práticas foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Colorado State University, que concorda com os “Princípios Orientadores para

81 Ética de Pesquisa” dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos. Os testes realizados tiveram o intuito de avaliar as propriedades coagulantes do material, através dos testes de adesão e ativação plaquetária, adsorção de proteínas e coagulação sanguínea, de forma a sugerir sua aplicação no corpo humano. Para todos os testes de hemocompatibilidade foram utilizados como controle discos de polietileno, para comparação com as nanofibras.

5.2.10.1. Adesão e ativação plaquetária

Para avaliar a propriedade coagulante das nanofibras foram realizados testes de adesão e ativação plaquetária, utilizando plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP foi mantido em contato com as nanofibras por 2 h. Foram realizadas imagens por espectroscopia de fluorescência, para avaliar a área coberta por plaquetas nas nanofibras, e também imagens de MEV, para avaliar a morfologia das plaquetas aderidas na superfície das nanofibras, de forma a correlacionar com a sua ativação. A área coberta foi calculada com o auxílio do programa ImageJ pelas imagens feitas no microscópio de fluorescência (a resolução de 20 x) para cada amostra, e foi tomado como base o número de áreas coloridas pela calceína (figura 34).

A adesão de plaquetas na superfície de biomateriais é um indicador de trombogenicidade e atividade coagulante, pois pode levar à ativação plaquetária, iniciando a cascata de coagulação. A figura 34a ilustra a adesão das plaquetas (coradas em verde) na superfície das nanofibras e do controle de polietileno. Pode-se perceber um aumento expressivo do número de plaquetas aderidas a superfície das nanofibras quando comparadas ao controle de polietileno. O que é justificado, devido à mudança de topografia da superfície, onde o controle possui uma superfície de menor rugosidade e bidimensional. Por possuírem estrutura tridimensional e superfície rugosa com poros, as nanofibras tendem a apresentar maior deposição de plaquetas e proteínas em sua superfície (LESZCZAK; POPAT, 2014; MERKLE

et al., 2015; RIEDEL et al., 2012; ZENG et al., 2016). No entanto, quando comparadas com as

nanofibras de PVA, as nanofibras com incorporação de CMKC apresentam maiores valores de adesão plaquetária. De acordo com a figura 34b, as nanofibras com CMKC possuem maior área coberta por plaquetas, com diferença estatística significativa. Este resultado leva a crer que a propriedade está relacionada a presença do polissacarídeo modificado na composição. Possivelmente, a CMKC pode apresentar comportamento trombogênico semelhante ao precursor κ-carragenana, bem como a formação de sítios éster por reticulação com o PVA podem estar contribuindo para esse fator (MA et al., 2015; SILVA et al., 2010).

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Figura 34 – Imagens de fluorescência das plaquetas aderidas nas nanofibras e controle (a) e área coberta em porcentagem (c). Valores representam média ± desvio padrão (N = 3). **** p ≤ 0,0001, ** p ≤ 0,01, * p ≤

0,05 e “ns” p ≥ 0,05.

Fonte: Autor (2019)

A ativação plaquetária é um fenômeno rápido que ocorre quando as plaquetas interagem com substratos estranhos. A ativação plaquetária é caracterizada por alterações morfológicas nas plaquetas aderidas, incluindo espalhamento, formação de dendritos e subsequente agregação plaquetária (SABINO, Roberta M et al., 2020; ZANG; POPAT; REYNOLDS, 2018). Extensões dendríticas e agregação plaquetária alteram o tamanho das plaquetas (2 - 3

83 μm) de uma forma redonda (não ativada) para uma morfologia ativada, indicando a ativação plaquetária (SIMON-WALKER et al., 2017b). De forma a avaliar a morfologia das plaquetas aderidas nas nanofibras foram realizadas imagens no MEV (figura 35). As imagens foram feitas com ampliações de 2000 x. Os resultados obtidos pelo MEV concordam com os anteriores, de forma que as plaquetas aumentam a medida que a porcentagem de CMKC aumenta. No entanto, todas as plaquetas apresentam formação de dendritos e diminuição de formato arredondado, o que indica que todas estão ativadas, sugerindo que o material possui uma tendência a formar coágulos e promover a coagulação.

Figura 35 – Imagens de MEV das plaquetas aderidas na superfície das nanofibras e controle.

Fonte: Autor (2019)

5.2.10.2. Adsorção de proteínas

A formação de um coágulo sanguíneo é o resultado de agregados de plaquetas e uma rede de fibras de fibrina reticulada, através de diversas etapas da cascata de coagulação. A monocamada de proteínas que adsorve na superfície do biomaterial serve como mediador inicial para iniciar a formação de um coágulo e sua composição pode ditar processos biológicos proteicos subsequentes. A albumina (ALB) é uma das proteínas mais abundantes no sangue, e sua adsorção pode bloquear ou promover a formação de coágulos, a depender da sua

84 conformação nativa ou desnaturação na superfície (PAAR et al., 2017; RASMUSSEN et al., 2016). O fibrinogênio (FIB) é uma proteína altamente anisotrópica e precursora da fibrina. O FIB desempenha papéis importantes na formação de coágulos sanguíneos, fornecendo locais de ligação para plaquetas e polimerizando para formar fibras de fibrina reticuladas (SABINO, Roberta Maia et al., 2019a; ZANG; POPAT; REYNOLDS, 2018).

Sendo assim, espectros de XPS de alta resolução para C1s e de amplo espectro foram coletados para as superfícies após a incubação em soluções de albumina e fibrinogênio humanos. A composição elementar foi utilizada para investigar a quantidade de fibrinogênio adsorvido nas superfícies do material (tabela 6). Como as proteínas contêm altos níveis de nitrogênio, o aumento no teor de nitrogênio nas superfícies se deve à adsorção de albumina ou fibrinogênio (tabela 7).

De acordo com a tabela 6, nenhuma das nanofibras estudadas possuem nitrogênio em sua composição elementar antes do ensaio de adsorção de proteínas. Quando analisados novamente após o ensaio, as nanofibras todas as nanofibras apresentaram um teor aumentado de nitrogênio, como observado na tabela 7.

Tabela 6 – Composição elementar das nanofibras determinado por análise XPS.

% C1s % N1s % O1s % S2p PVA 70,53 0,00 29,47 0,00 PVA-CMKC 25% 66,78 0,00 32,79 0,43 PVA-CMKC 50% 61,19 0,00 38,50 0,31 PVA-CMKC 75% 65,45 0,00 34,18 0,37 Fonte: Autor (2019)

Tabela 7 – Teor de nitrogênio nas nanofibras determinado antes e após o ensaio de adsorção de fibrinogênio e albumina.

% N (reticulada) % N (fibrinogênio) % N (albumina)

PVA 0,00 5,28 3,03

PVA-CMKC 25% 0,00 3,38 1,83

PVA-CMKC 50% 0,00 4,69 0,17

PVA-CMKC 75% 0,00 3,13 0,61

85 O FIB adsorvido pode servir como mediador primário de adesão e ativação plaquetária na cascata de coagulação. Sendo assim, um aumento na adsorção de fibrinogênio nas nanofibras pode ser correlacionado a um aumento na capacidade coagulante do mesmo. Já a ALB pode bloquear ou promover a formação de coágulos, dependendo da conformação adotada ou desnaturação. Quando observados os valores da tabela 7, pode-se perceber que todas as nanofibras possuíram um incremento no teor de nitrogênio, com maior valor sendo do PVA tanto para FIB, quanto para ALB. O que poderia vir a sugerir que as nanofibras de PVA deveriam apresentar maior atividade trombogênica. No entanto, ao observar os espectros de alta resolução de C1s obtidos pelo XPS (figura 36), a presença do pico de amida (N-C=O) para o PVA após o ensaio com ALB não apresenta aumento, o que pode ser atribuído a uma possível desnaturação do ALB, diminuindo assim o número de plaquetas aderidas, como visto em testes anteriores. Quando avaliados os valores de incremento no teor de nitrogênio para as nanofibras com CMKC, pode-se perceber uma baixa adsorção de albumina e elevada adsorção de fibrinogênio, que é confirmado pelos espectros de alta resolução de C1s (figura 36) e corrobora com os resultados de adesão e ativação plaquetária, onde o aumento da incorporação de CMKC promoveu maior adesão e ativação plaquetária.

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Figura 36 – Espectros de alta resolução de C1s antes e após o ensaio de adsorção de fibrinogênio e albumina.

Fonte: Autor (2019)

5.2.10.3. Coagulação sanguínea

Ensaios de coagulação sanguínea utilizando o sangue humano (plasma e eritrócitos) nas superfícies dos materiais demonstram os efeitos combinados de fatores pró-coagulantes, adesão / ativação de plaquetas, oferecendo assim uma visão geral da relação entre as propriedades da superfície e as reações bioquímicas envolvidas na resposta hemostática. Embora a investigação dos componentes individuais da cascata possa oferecer informações sobre os mecanismos específicos, com a superfície do material promovendo a amplificação da cascata de coagulação, a coagulação do sangue oferece o índice de trombogenicidade mais clinicamente relevante, apresentando os efeitos combinados de todos os componentes (SABINO, Roberta Maia et al., 2019a; SIMON-WALKER et al., 2018).

Após coletado, colocou-se o sangue em contato com as nanofibras por 15 e 30 minutos, para avaliar a atividade coagulante do material. Seguindo o procedimento já descrito, foi então avaliada a quantidade de hemoglobina livre por adição de água no coágulo formado, seguido

87 de leitura da absorbância. Para 0% de coagulação / 100% de hemoglobina livre foi utilizada uma amostra de sangue em água no tempo 0 (assim que coletado o sangue do indivíduo) e sua absorbância medida. A figura 37 ilustra os resultados obtidos de percentual de coagulação do sangue humano em contato com as nanofibras por 15 e 30 minutos. Pode-se perceber que as nanofibras com maiores valores de incorporação de CMKC obtiveram percentuais de coagulação estatisticamente significativamente maiores que as nanofibras de PVA, chegando a alcançar valores próximos de 80%. Este resultado corrobora com os resultados anteriores de adesão e ativação plaquetária e adsorção de proteínas séricas, o que nos leva a crer que as nanofibras de PVA com incorporação acima de 50% de CMKC são fortes candidatas para aplicação em curativos para ferimentos por possuírem atividade coagulante.

Figura 37 – Percentual de coagulação do sangue humano em contato com as nanofibras por 15 e 30 minutos. Valores representam média ± desvio padrão (N = 3). * p ≤ 0,05 e “ns” p ≥ 0,05.

Fonte: Autor (2019)

5.2.11. Atividade antibacteriana

Em ferimentos, diversas são as formas de contaminação e colonização por bactérias. Na ferida, são produzidas inicialmente diferentes quantidades de exsudato rico em células mortas, fragmentos de tecido, sujeira e bactérias. Se grandes quantidades de exsudato permanecem na ferida, a recuperação é dificultada e o risco de infecção aumenta, por servirem de nutrientes para colonização (JONES; GREY; HARDING, 2006; TSEKOVA et al., 2017). Por esses motivos, é desejável que curativos para ferimentos possuam atividade antibacteriana.

88 Para as análises de atividade antibacteriana das nanofibras, foram utilizadas duas cepas de bactérias, Staphylococcus aureus (gram-positiva, ATCC 6538) e Pseudomonas aeruginosa (gram-negativa, P01). Foram realizados testes de inibição de crescimento bacteriano em solução por adição das nanofibras e adesão e crescimento bacteriano na superfície das nanofibras, como forma de avaliar a atividade antibacteriana.

5.2.11.1. Inibição de crescimento em solução

Se bactérias estiverem presentes no exsudato de uma ferida, é importante que a presença do material possa absorver e inibir o crescimento dos microorganismos, dessa forma, produtos metabólicos nocivos ao tecido podem ser evitados. Sendo assim, as nanofibras foram imersas em solução nutriente com suspensão bacteriana e mantidas em contato por 6 h e 24 h. Após esse período, a suspensão foi analisada através da densidade ótica e calculado a porcentagem de inibição de crescimento, tendo uma solução nutriente com bactérias como positivo. A figura 38 ilustra os valores em percentual de inibição de crescimento bacteriano em solução em contato com as nanofibras. Para a bactéria gram-positiva S. aureus, não houve diferença estatística significativa entre as amostras em 6 h e 24 h, chegando a valores superiores de 60% de inibição. No entanto, após 24 h de crescimento, pode-se perceber que os valores de inibição decaem, chegando a um máximo de 40% para a nanofibra com 75% de incorporação de CMKC. Bactérias gram-positivas possuem uma camada espessa de peptideoglicanos em sua parede celular, o que as torna bastante resistentes e dificulta processos de rompimento da membrana por ação das nanofibras ou polímeros (SALTON, 1953). Porém, por se tratar de uma técnica que avalia somente a densidade ótica, não se pode afirmar que as bactérias presentes na solução após 24 h estão vivas.

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Figura 38 – Percentual de inibição de crescimento bacteriano em solução contra as bactérias: Staphylococcus aureus (a) e Pseudomonas aeruginosa (b). Valores representam média ± desvio padrão (N = 3). * p ≤ 0,05 e

“ns” p ≥ 0,05 em comparação com PVA.

Fonte: Autor (2019)

Os dados de inibição de crescimento não apresentaram diferença estatística significativa entre as amostras para a bactéria gram-negativa P. aeruginosa. Porém, se comparados ao comportamento perante a bactéria gram-positiva, o percentual de inibição de crescimento não sofreu um decaimento elevado. Bactérias gram-negativas possuem uma parede celular mais complexa, porém com camada fina de peptideoglicanos e lipopolissacarídeos, o que as torna mais sensível a cargas superficiais que podem estar presentes nas nanofibras (ALI, 2018). Em uma análise preliminar, a presença das nanofibras na suspensão bacteriana tende a inibir o crescimento dos microorganismos, o que pode ser associado a morte dos mesmos ao se depositarem nas nanofibras. No entanto, para isso se faz necessário o estudo do crescimento e adesão na superfície das nanofibras.

5.2.11.2. Adesão e crescimento bacteriano na superfície

Feridas expostas são ambientes viáveis para a colonização de bactérias, especialmente as presentes na pele. Dessa forma, se faz necessário materiais que tendam a repelir ou matar as bactérias que venham a se aderir na sua superfície (FINDLEY et al., 2013; VALLET-REGÍ; GONZÁLEZ; IZQUIERDO-BARBA, 2019). Para avaliar o comportamento bacteriano quanto a adesão e crescimento na superfície das nanofibras, suspensões bacterianas foram adicionadas às nanofibras e mantidas em contato por 6 h e 24 h, com posterior análise através de microscopia de fluorescência e MEV. As imagens de fluorescência foram usadas para avaliar o estado das bactérias que se depositaram no material. O corante verde (SYTO9) é permeável a membrana

90 das bactérias, indicando as bactérias vivas que estão depositadas na nanofibra. Já o corante vermelho (iodeto de propídio), não é permeável a membrana, somente corando as bactérias que possuem algum defeito ou falha em sua membrana, o que caracteriza bactérias mortas na superfície. A figura 39 ilustra as imagens de microscopia de fluorescência da S. aureus em contato com as nanofibras. É possível perceber que após 6 h de crescimento, houve pouca deposição de bactérias na superfície das nanofibras e que as nanofibras com maior incorporação de CMKC não apresentaram grande presença de bactérias vivas, diferentemente das nanofibras de PVA. Após 24 h de cultivo, as nanofibras de PVA apresentaram um aumento expressivo do número de bactérias, especialmente vivas. As nanofibras com incorporação de 25% e 75% CMKC apresentaram considerável menor número de bactérias depositadas, bem como maior número de bactérias mortas na superfície. No entanto, a nanofibra com incorporação de 50% de CMKC apresentou um grande número de bactérias depositadas se comparada as nanofibras com CMKC. Este comportamento anômalo foi associado a maior hidratação das nanofibras de 50%, mostradas no experimento inicial (tabela 5). Dessa forma, é possível sugerir que o aumento da incorporação de CMKC nas nanofibras promove um aumento na atividade antibacteriana contra a bactéria gram-positiva S. aureus.

Figura 39 – Imagens de fluorescência da Staphylococcus aureus em contato com as nanofibras após 6 e 24 h. O corante verde indica bactérias vivas e o corante vermelho bactérias mortas. Ampliação de 50x.

Fonte: Autor (2019)

Para avaliar a morfologia das bactérias, foram utilizadas imagens de MEV das nanofibras com as bactérias fixadas em sua superfície. A figura 40 mostra as imagens das

91 nanofibras após 6 h e 24 h de contato com S. aureus em ampliação de 2.000x e 5.000x, que corroboram com os resultados de microscopia de fluorescência. Pode-se perceber a morfologia esférica semelhante a “cachos de uva”, característicos de estafilococos em ambas as ampliações. Em ampliação de 2.000x, a área das nanofibras coberta por bactéria é semelhante à mostrada pelas imagens de microscopia de fluorescência, em 6 h e 24 h. Já em 5.000x, pode-se visualizar bactérias com diferenças na sua morfologia, especialmente nas nanofibras com incorporação de CMKC. Após 24 h, algumas bactérias apresentam formato elíptico, bem como pode-se visualizar bactérias com a membrana defeituosa e mortas.

Figura 40 – Imagens de MEV da Staphylococcus aureus em contato com as nanofibras após 6 e 24 h. Ampliação de 2.000x e 5.000x.

Fonte: Autor (2019)

A figura 41 ilustra as imagens de microscopia de fluorescência da P. aeruginosa em contato com as nanofibras. Diferentemente da bactéria gram-positiva, que possui uma parede celular espessa de peptideoglicanos, a P. aeruginosa é uma bactéria em forma de bacilos e

92 gram-negativa, com parede celular complexa e fina, se comparada com a anterior. Avaliando as imagens de fluorescência, pode-se perceber uma maior deposição de bactérias em todas a nanofibras, o que pode ser explicado pela maior mobilidade da bactéria, que apresenta flagelos em sua estrutura (FREDUA-AGYEMAN; GAISFORD; BEEZER, 2018; SAID et al., 2014). No entanto, apesar de maior adesão nas nanofibras, após 6 h de crescimento, a quase totalidade das bactérias depositadas nas nanofibras com incorporação de CMKC foram coradas de vermelho, o que caracteriza bactérias mortas. Após 24 h, pode-se perceber um aumento no número de bactérias vivas na fibra de PVA e poucas bactérias vivas nas fibras com CMKC, em especial as de 75%, que apresentam elevado número de bactérias mortas na superfície. Além disso, é possível observar uma diminuição no tamanho das bactérias após 24 h, o que caracteriza o início da fase de decaimento da bactéria.

Figura 41 – Imagens de fluorescência da Pseudomonas aeruginosa em contato com as nanofibras após 6 e 24 h. O corante verde indica bactérias vivas e o corante vermelho bactérias mortas.

Fonte: Autor (2019)

Para avaliar a morfologia das bactérias, foram utilizadas imagens de MEV das nanofibras com as bactérias fixadas em sua superfície. A figura 42 mostra as imagens das nanofibras após 6 h e 24 h de contato com P. aeruginosa em ampliação de 2.000x e 5.000x, que corroboram com os resultados de microscopia de fluorescência. Pode-se perceber a morfologia bacilar, característicos da bactéria, em ambas as ampliações. Após 6 h já é possível perceber a presença de falhas ou até mesmo mudanças na morfologia das bactérias sob a superfície das nanofibras, caracterizando a morte. É importante salientar que a P. aeruginosa é uma bactéria produtora de biofilme, um mecanismo de defesa que a torna um patógeno de difícil combate (NEUFELD; REYNOLDS, 2016; PARICIO; NEUFELD; REYNOLDS, 2019). Dito isso, após

93 24 h de crescimento, pode-se perceber a presença de “mucos” em algumas figuras em ampliação de 2.000x, no entanto, ao observar as figuras de maior ampliação, é possível visualizar um início de formação de biofilme em todas as nanofibras, porém, ao que parece, as bactérias estão mortas, o que corrobora com os dados obtidos através de microscopia de fluorescência. Nas imagens da nanofibra de maior incremento de CMKC é possível observar um elevado número de bactérias depositadas e mortas, se comparadas as outras nanofibras.

Figura 42 – Imagens de MEV da Pseudomonas aeruginosa em contato com as nanofibras após 6 e 24 h. Ampliação de 2.000x e 5.000x.

Fonte: Autor (2019)

Avaliando ambos os dados para as bactérias, é possível sugerir o efeito antibacteriano das nanofibras por alguns fatores: por possuírem paredes celulares rígidas, bactérias gram- positivas e gram-negativas não possuem a capacidade de se adaptar facilmente a estruturas em escala nanométrica, o que pode provocar a morte por adesão a superfície nanométrica das fibras (ALI, 2018; VALLET-REGÍ; GONZÁLEZ; IZQUIERDO-BARBA, 2019); o aumento da

94 hidrofobicidade das nanofibras por reticulação do PVA com a CMKC pode promover a formação de uma camada de água na superfície gerando uma barreira física e energética para a deposição das bactérias (VALLET-REGÍ; GONZÁLEZ; IZQUIERDO-BARBA, 2019; WANG, L.; HU; SHAO, 2017); a presença de cargas na superfície devido aos grupamentos carboxílicos e sulfato da CMKC nas nanofibras pode interagir com a parede e membrana celular das bactérias, afetando canais de troca iônica e enzimas respiratórias, bem como a integridade da membrana em si, causando a morte das bactérias (ALI, 2018; PAJERSKI et al., 2019).

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