Chargement du AH-38

La différence entre les aminostéroïdes RM-133 et AH-38 sur le plan structurel est l'absence de la fonction éthinyl sur le C17 du noyau stéroïdien (Figure 19). L'utilité de cet alcyne sur l’aminostéroïde RM-133 était de ralentir la vitesse de métabolisation sur l’alcool adjacent présent sur le même carbone. L’aminostéroïde circulait plus longtemps dans le système sanguin grâce à la meilleure stabilité systémique. L’efficacité thérapeutique générale de l’aminostéroïde AH-38 est également prometteuse contre les lignées cancéreuses, toutefois les IC50 diffèrent des valeurs obtenues avec l’aminostéroïde RM-133 selon la souche

de cellules évaluées (Tableau 7). De plus, la perte du groupement éthinyl n’intervient pas au niveau de la solubilité aqueuse du noyau stéroïdien, car il a autant de fonctions permettant des interactions électrostatiques et la taille du groupement perdu est infime par rapport au reste de la molécule.

Figure 19. Différence entre les structures des aminostéroïdes RM-133 et AH-38

Tableau 7. Comparaison de l'efficacité thérapeutique sur différentes lignées entre l'AH-38 et le RM-133

IC50 de lignées cancéreuses (µM)83

Aminostéroïde bioactif _(Leucémie) HL-60 MCF-7 _(Sein) T-47D _{(Sein) (Prostate)} LNCaP

AH-38 1,6 0,1 0,1 0,04

RM-133 0,1 0,1 0,1 2,0

La synthèse de la molécule d'espacement a été effectuée à nouveau en se servant de l’aminostéroïde AH- 38. Les mêmes conditions d’estérification de Steglich ont été utilisées pour former l'espaceur. Toutefois, la CCM de la réaction montrait deux produits différents dans le mélange réactionnel. En effet, il était logique qu’il y ait une compétition de réactivité entre l’alcool en C3 et en C17 du noyau stéroïdien, puisque

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désormais l’alcool en C17 était lui aussi secondaire. Le produit majoritaire a été isolé par colonne chromatographique dans les mêmes conditions d'élution. Suite à l'analyse du spectre RMN 1_{H, il a été}

possible de déterminer quel alcool était le plus propice à subir une estérification. Il a été démontré que l’alcool en position 17β sur un noyau stéroïdien est plus réactif que celui en position 3α. En effet, l’alcool sur le C3 est en position axiale, cette conformation nécessite une énergie d’activation plus élevée que la position équatoriale puisqu’il faut surmonter la congestion stérique induite par les interactions 1,3-diaxiales. Quant à l’alcool sur le C17, il est dans la position équatoriale, donc il n’y a pas les interactions stériques défavorables favorisant cinétiquement l’estérification à cette position à cause de l’accès plus facile pour l’acide carboxylique. L’analyse comparative entre les spectres RMN 1_{H de l’espaceur et de l’AH-38 prouve}

l’obtention de l’isomère de position de l’ester sur l’alcool 17β par le déplacement du signal de l'hydrogène en C17 vers les hauts champs.

En effet, le proton en C17 sur l’AH-38 est identifié avec un déplacement chimique de 3,6 ppm alors que le proton en C3 se trouve à 3,1 ppm. Après la réaction d’estérification, un nouveau pic est aperçu à 4,6 ppm, le déplacement chimique allant vers les hauts champs prouve que l’estérification a fonctionné et qu’elle diminue la densité électronique autour d’un proton adjacent à l’ester nouvellement formé. Dans ce spectre, il est possible de voir la perte d’un proton dans l’intensité du pic à 3,6 ppm et la conservation d’intensité à 3,1 ppm, cela démontre que l’ester est formé sur l’alcool en position 17 du noyau stéroïdien. Le rendement de cette estérification compétitive est de 69 % (Schéma 20).

CH₂Cl₂, 25 °C, 16 h EDC, DMAP OH O N O N O N N OH HO N O N O N N O HO 69 % O

Schéma 20. Synthèse de l'isomère de position majoritaire de l’hept-6-ynoate d’AH-38

Suite à la caractérisation de l’isomère de la molécule d’espacement d’AH-38 obtenu, le greffage entre l’espaceur d'AH-38 et le PEOT a été effectué afin de confirmer que le problème de solubilité du nanotransporteur était bel et bien relié à la réactivité de l’alcyne en C17 de l’aminostéroïde RM-133. Les conditions réactionnelles déterminées avec l’espaceur d’ADT ont été optimisées pour le test du greffage de 10 équivalents de la molécule d’espacement d’AH-38 sur le dendrimère PEOT de G3 (Schéma 21).

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Schéma 21. Formation du G3-EO3-EO2-(AH-38)(10/16)-COOH(6/16)

En ce qui concerne la réaction de CuAAC, elle a été optimisée pour obtenir des conditions pour les trois générations du dendrimère PEOT. La charge catalytique de cuivre a été introduite en excès par rapport à la quantité d'alcynes à faire réagir. Cette stratégie a été employée pour augmenter le nombre de rencontres entre les molécules d'espacement, les terminaisons du PEOT et les molécules de cuivre. Cela implique une meilleure distribution dans le milieu réactionnel et un taux de conversion optimal puisque les méthodes d'inactivation du catalyseur métallique n'affectent pas toutes les molécules de cuivre. Ainsi, comme la réaction ne nécessite pas un apport stœchiométrique de catalyseur pour s’effectuer, elle peut compléter la cycloaddition avec le cuivre actif en solution. Du point de vue de l'élimination du cuivre, l'utilisation d'une solution saturée de chlorure d'ammonium (NH4Cl), lors de l'extraction liquide-liquide, favorise l’élimination

de l'excès de catalyseur inséré dans les vides interbranches des différentes générations de dendrimère. De surcroît, la dialyse suivant la fonctionnalisation des terminaisons en groupements hydrophiles élimine de moitié la quantité des petites molécules dans le milieu. Ainsi, la quantité de cuivre dans le produit final tend vers 0, mais il en reste sous forme de traces.

Suite à la CuAAC, le produit obtenu était soluble dans plusieurs solvants d’extraction organiques tels que le CHCl3, l'AcOEt et le CH2Cl2. Cette caractéristique confirme l’hypothèse d’hyperbranchement des

dendrimères sur les deux alcynes présents dans la structure de l’hept-6-ynoate de RM-133. Le lot synthétisé comporte une moyenne de 10 molécules d’AH-38 par dendrimère. Celle-ci a été analysée par RMN 1_{H avant l’ajout des groupements hydrophiles pour quantifier le taux de conversion des alcynes. Cette}

analyse n'a pas permis de mesurer le taux de fonctionnalisation sur la macromolécule, car il y avait trop d’interférence dans la région aromatique du spectre RMN 1_{H. Ces interférences empêchaient l'intégration}

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Toutefois, l'ajout des groupements hydrophiles sur les terminaisons non-réagies a été effectué sans confirmation du taux de chargement. L’acide but-2-yne-1,4-dioïque a été mis en excès dans le milieu réactionnel pour s'assurer que toutes les terminaisons ont réagi. Finalement, le test de solubilité qualitatif dans l’eau légèrement basique a démontré que le nanotransporteur se dissolvait dans cette solution. Étant donné les résultats positifs observés sur le nanotransporteur de G3, les synthèses pour former les «pro-médicaments» de G1 et de G2 avec l’espaceur d’AH-38 ont débuté. En se servant du taux de chargement maximum déterminé avec l’hept-6-ynoate d’ADT, les plateformes de G1 possédant en moyenne 2 molécules d’AH-38 et les dendrimères G2 conjuguées en moyenne avec 5 aminostéroïdes ont été synthétisés. Ensuite, l’ajout des groupements hydrophiles s’est effectué sans caractérisation sur les terminaisons restantes. Les ratios de greffage du composé bioactif sur les terminaisons du PEOT sont théoriques, car il n’est pas possible de confirmer le taux de conversion par RMN 1_{H. Finalement,}

l’élimination des catalyseurs de cuivre est réalisée à l’aide de la méthode de dialyse comme il a été expliqué à la section 2.4.3. Suite à la purification par dialyse, l’eau dans la membrane est partiellement évaporée sous pression réduite puis les traces d’eau restantes ont été lyophilisées à l’aide du lyophilisateur.

Finalement, les nanotransporteurs de différentes générations sont retrouvés sous forme de gommes pâteuses puisqu'ils emprisonnent du solvant dans le vide interbranche. Sous forme de gomme, ils sont difficiles à manipuler à cause de leurs tendances à coller sur les parois de verre et sur les spatules. Cependant, lorsque les «pro-médicaments» deviennent totalement secs, ils sont nettement plus longs à solubiliser, peu importe la nature du solvant. Ce facteur s'explique par l’entremêlement des chaînes qui nuisent à la capacité de mouvement des branches, un critère essentiel pour la solubilisation de macromolécules. Afin de retrouver une bonne capacité de mouvement pour se solubiliser, les dendrimères secs requièrent de l’énergie souvent obtenue par un chauffage léger.

Comme l'analyse des spectres RMN 1_{H ne permettait pas la caractérisation du taux de chargement de l’AH-}

38, une méthode d'analyse par spectroscopie UV-Vis a été employée pour déterminer le taux de fonctionnalisation. Grâce à cette méthode, le professeur James R. Baker Jr. a confirmé la liaison entre un espaceur comportant une molécule de MTX et un dendrimère PAMAM.85 _{La méthode permettait d’observer}

la présence ou l’absence d'une longueur d’onde caractéristique au médicament. En s’inspirant de l'article du professeur Baker Jr., une expérience a été façonnée pour que la technique puisse évaluer la masse moyenne de molécules AH-38 conjuguées aux différentes générations de PEOT.

Pour ce faire, un balayage entre 200 nm et 800 nm sur une solution d’AH-38 diluée à 0,1 mg/mL dans le THF a été effectué. Une bande d’absorption intense à 314 nm était influencée par la concentration d’AH-38 en solution. En utilisant cette longueur d’onde d’absorption, une courbe d’étalonnage de l'absorbance des

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solutions d'AH-38 par rapport à la concentration en mg/mL a été obtenue. La droite de régression linéaire expose une excellente corrélation linéaire entre les différents points de la courbe (Figure 20). Pour que ce système puisse être valable, il fallait tenir compte de la loi de Beer-Lamber selon laquelle la linéarité entre une concentration et une mesure d'absorbance nécessite des points entre 0,1 et 1 unité atomique d’absorbance.

Figure 20. Graphique de la courbe d'étalonnage de l'absorbance UV-Vis de l'AH-38 à 314 nm selon la concentration d'AH-38

Ensuite, une masse précise d’un nanotransporteur dans un volume précis de THF a été analysé pour calculer la masse relative des molécules d’AH-38 par rapport à la masse totale des «pro-médicaments». Les tableaux ci-dessous montrent les valeurs d’absorbance des différentes macromolécules exposées à une longueur d'onde de 314 nm. En utilisant ces valeurs, il a été possible de déterminer la concentration, en mg/mL, d’AH-38 dans la solution pour chaque génération. La dilution ayant été faite dans 10 mL de THF, la masse d’AH-38 fut calculée rapidement comme l’a été le pourcentage massique qui se trouve en divisant la masse d’AH-38 par la masse totale de nanotransporteur introduite dans la solution (Tableau 8 et Tableau 9).

Le Tableau 8 représente les taux de fonctionnalisation pour les trois générations avec les conditions de CuAAC déterminées avec l'espaceur d'ADT, soit 0,3 (G1-G2-) ou 0,5 (G3) équivalent de CuSO4 par alcyne.

Quant auTableau 9, celui-ci montre la fonctionnalisation avec les conditions optimisées de la réaction de CuAAC, soit 1,3 (G1-G2) ou 1,5 (G3) équivalent de CuSO4 par alcyne. Une augmentation générale du taux

moyen de conversion des alcynes en cycles 1,2,3-triazoles peut être observée. Les G1, G2 et G3 du PEOT

y = 5,516x - 0,020 R² = 0,999 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Ab so rb an ce (u .a .) Concentration d'AH-38 (mg/mL)

Analyse de l'absorbance UV à 314 nm

selon la concentration d'AH-38 libre en

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augmentent respectivement d’un pourcentage massique d'AH-38 sur les nanotransporteurs de 24 %, 24 % et 35 % en utilisant une charge catalytique de 0,3/0,5 équivalent de CuSO4 à un pourcentage massique de

38 %, 36 % et 43 % pour 1,3/1,5 équivalent de catalyseur de cuivre.

Tableau 8. Conversion de la mesure d'absorbance de la molécule AH-38 fonctionnalisée au PEOT en pourcentage massique de composé bioactif sur les générations de dendrimère (0,3/0,5 équiv. CuSO4)

Moyenne (u. a.) Concentration (mg/mL) Masse PEOT (mg) % massique d'AH-38 G1 0,24830 0,049 2,06 24% G2 0,24301 0,048 1,98 24% G3 0,41345 0,079 2,23 35%

Tableau 9. Conversion de la mesure d'absorbance de la molécule AH-38 fonctionnalisée au PEOT en pourcentage massique de composé bioactif sur les générations de dendrimère (1,3/1,5 équiv. CuSO4)

Moyenne _{(u. a.)} Concentration _(mg/mL) Masse PEOT _(mg) % massique d'AH-38 G1 0,38706 0,074 1,95 38%

G2 0,33979 0,065 1,99 36% G3-360 0,39792 0,076 1,92 43%