Cellular Uptake Studies

Figure 3. Reversal of zeta potential with addition of successive polyelectrolyte layers. (n=6, error bars  represent standard deviations). 

3.3 Cellular Uptake Studies

Cellular uptake of double‐chambered nanoparticles by MDCK cells was qualitatively investigated  employing confocal fluorescence imaging as shown  in  Figure 4.  Images were recorded in 3  channels: the blue channel (DAPI) shows cell nuclei covering the slide. The green channel shows  fluorescence signal of Flu, which is the signal of the model small molecule loaded in the core (inner  chamber). The red channel shows the fluorescence signal of Lys‐RhD, which is the signal of the 

model labelled protein loaded in the outer LbL layer (external chamber). Figure 4 shows a gallery of  confocal images in which (a) to (g) represent progressive sections from the top downwards  throughout the cell layer thickness, each spaced by 1 µm. Obvious fluorescence signal in the  perinuclear region in both green and red channels indicate particle uptake. Going through stacks  from (a) to (g) shows stronger signals in the mid focal planes, clearly pointing out that particles  were internalized and not only adsorbed at the cell surface. Furthermore, by overlaying both  fluorescent channels, we observed that fluorescent spots are superimposed, as evident by the  appearance  of  yellow  color,  indicating  co‐localization  of  both  compounds  into  same  cells. 

Moreover, the particles appear to aggregate in an intracellular compartment, some appear sharply  defined, some appear more diffused indicating that some particles already started releasing the  compounds intracellularly after 4h of incubation.  

Figure 4. Confocal laser scanning microscopy images showing progressive sections from the top downwards at 1 µm intervals (a)‐(g).  Scale bar indicates 20 µm.   

4 Conclusions

In this report, a simple and time‐efficient method for LbL deposition is described, resolving issues  related to coating of small charged nanoparticles. The new method depends on the use of  concentration  tubes  to  remove  excess  liquid  instead  of  particle  precipitation,  especially  advantageous when charged nanocores (e.g., PLGA nanoparticles) tend to aggregate under high  centrifugation speeds. This method was used to develop a double chambered nanocarrier system  capable of carrying two different species of model compounds, a protein and a small molecule, in 2  defined and separated compartments. The produced particles were shown to be internalized by  MDCK cells. This LbL technique allows the coating of many types of delicate cores and opens the  door for more versatile applications of this technology. 

5 References

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Rapid Commun., 21 (2000) 750‐753. 

Final Conclusions and Outlook

Layer‐by‐Layer technology (LbL), a technique based on the deposition of oppositely charged  polyelectrolytes layer‐wise on the surface of interest, has gained increasing interest in the field of  drug delivery. The presented work in this thesis explores new applications for Layer‐by‐Layer (LbL)  technology in the field of controlled protein delivery. The basic motives for these studies were the  protein‐friendly mild formulation conditions where only aqueous solutions are used, in contrast to  organic solvents typically employed in the fabrication of many other protein formulations, thus  correct protein folding and activity are preserved. 

In the first chapter, LbL structures encapsulating enzymes as a representative of functional proteins  were reviewed. We could show the versatility and flexibility of the technology and the different  added values it brings to the formulation such as; increased stability, response control functionality  and sequential action when loading 2 different enzymes. In addition, special attention was paid to  show different common techniques used to characterize LbL structures, such as studying layer  deposition by UV absorbance and quartz crystal microbalance (QCM), showing charge reversal  using  zeta potential measurements, and different imaging techniques like  scanning  electron  microscopy (SEM), atomic force microscopy (AFM) beside several enzyme‐specific activity tests. 

The  second  chapter  reviews  the  use  of  biopolymer‐based  delivery  systems  as  carriers  for  intracellular delivery of siRNA molecules into target cells. The recent progress in polymer science  led to a paradigm shift where biopolymers are not feared to suffer from poorly controlled and  irreproducible properties as they used to be, allowing to obtain pharma grade biopolymers. Several  biopolymers and modified biopolymers of interesting biocompatibility and/or biodegradability were  discussed as vectors for siRNA delivery. The biocompatibility, high tolerability and versatility of  these biopolymers are the main driving forces behind the interest of many scientific groups in  biopolymer‐based delivery systems. However, progress to clinical trials is still significantly delayed. 

In our point of view, the most important unmet challenge is efficient delivery of siRNA cargo  intracellularly to target cells, at sufficient doses needed for optimal effect. This should be preferably  done by systemic administration and with a sustained mode of action as the patient in a real word  setting cannot tolerate frequent injections.  

In the third chapter, the feasibility of LbL coatings to sustain the release of a model protein  (lysozyme) from microspheres was studied. LbL coating was composed of chondroitin sulfate as a  negatively charged polyelectrolyte and a biocompatible, hydrolytically degradable poly  β‐amino 

ester as a positively charged polyelectrolyte. Lys was loaded effectively on hydrogel microspheres  achieving about 9mg protein/100 mg wet spheres. Fluorescence imaging showed that lysozyme was  adsorbed homogenously on the microspheres surface. After loading, a series of LbL coatings of  different thicknesses were deposited and proved by reversal of zeta potential after each layer  deposition. In vitro release studies showed sustained release profiles that depend on the thickness  of the deposited coat, with t50% extended from 4.9h to 143.9h. More importantly, released Lys  possessed a high degree of biological activity during the course of release maintaining at least 72% 

of initial activity.  

These results were motivating to move from model protein into a real protein case. The presented  work in the fourth chapter investigates the feasibility of loading the clinically used embolic beads  (DC Bead^®) with Bevacizumab (BEV), an anti‐VEGF antibody, and control its release kinetics via  Layer‐by‐Layer (LbL) coating. This strategy has the aim to achieve high, localized and sustained  concentrations of BEV at the tumor site and reduce drug exposure in the systemic circulation. High  loading of BEV on lyophilized beads of about 76 mg BEV / DC Bead vial was achieved. LbL coating  was carried out by depositing alternating layers of the biocompatible polymers alginate and poly‐L‐

lysine. Coating was proven successful by monitoring the reversal of zeta potential after addition of  each layer. Morphological changes of the bead surface before and after coating were illustrated  using SEM imaging. Moreover, release profiles from different formulations were studied and results  showed that optimizing the number of deposited layers effectively slows the release of BEV for  three days. Activity of released BEV was studied in different 2D and 3D cell based assays. 

Interestingly, released BEV fractions showed comparable activity to fresh BEV solution used as  control after 3 days.  

The fifth chapter tackles the issue of co‐delivery of a protein and a small molecule drug into target  cells. The preparation of a novel double chambered, nanoparticulate system is described, applying  a simple and less time‐consuming LbL fabrication method using concentration tubes. Small poly  lactide‐co‐glycolide  (PLGA)  nanoparticles  loaded  with  fluorescein  base  as  a  model  small  hydrophobic molecule, represents the “internal chamber” while the “external chamber” is formed  of alternating polyelectrolyte layers containing lysozyme as a model protein. These nanocarriers  were taken up by MDCK cells in vitro, where a co‐localization of both model compounds was shown  by confocal imaging. 

To conclude, LbL technology provides an interesting option for controlling the release of active  biologicals from coated surfaces while retaining their activity. The presented work in this thesis lays  the foundation and provides a proof of concept that should to be taken further on. Some major  questions are still unanswered concerning the interaction between the drug and the layers, the  layers and beads surface and how these interactions control the release of the drug which is  apparently a process controlled by several factors. In addition, in vivo studies should be launched to  examine the behaviour of LbL formulations in biological systems.   However, a major challenge is  developing a better production technique that enables large scale production of LbL structures. The  current  used  processes  depend  mainly  on  successive  cycles  of  suspension/centrifugation/ 

resuspension, which makes the production time too lengthy. In addition, the large volumes needed  and wasted during production is quite a challenge.  

Working in the field of chemoembolization for about 3 years granted me a considerable amount of  knowledge that I aim to build on in the years to come. Apart from my PhD project herein described,  I developed a pharmaceutical formulation to face the challenge of loading water insoluble drugs to  embolic beads which is not doable using current technology. The formulation underwent several in  vitro investigations and was proven to be promising enough to win the University of Geneva  Innogap Award of novel product design (July 2014). This formulation depends greatly on lessons  learned during my work in the field of LbL technology. More research and investigations are due to  take this product to clinical trials. Interestingly, the case of this formulation product won the “Best  Business Concept Award” in the CTI competition (May 2015). Results of this work have not be  added to my thesis due to the ongoing patenting process. 

Résumé

La technologie d’assemblage couche‐par‐couche (LbL) est une technique basée sur le dépôt de  polyélectrolytes de charges opposées par couches sur une surface d’intérêt. Celle‐ci a rencontré un  intérêt croissant dans le domaine de l’administration des médicaments. Le travail présenté dans  cette thèse explore de nouvelles applications de la technique d’assemblage couche par couche  (LbL) dans le domaine du relargage contrôlé de protéines. Une motivation pour ces études était les  conditions douces  de formulations de protéines,  où  seulement  des solutions  aqueuses sont  utilisées, évitant les solvants organiques employés   lors de la fabrication de multiples autres  formulations de protéines. De cette manière, le repliement correct et l’activité des protéines sont  préservés. 

Dans le premier chapitre, nous présentons une revue du domaine de cette technologie couche‐par‐

couche (LbL) en termes de structures d’encapsulation d’enzymes comme modèles de protéines  fonctionnelles. Nous avons pu montrer la polyvalence et la flexibilité de cette technologie et les  différentes valeurs ajoutées qu’elle apporte à la formulation telle qu’une stabilité accrue, un  contrôle de la réponse et une libération séquentielle lors du chargement de deux enzymes  différentes. En outre, une attention particulière a été accordée pour présenter les différentes  techniques courantes utilisées pour caractériser les structures multicouches, telles que l’étude de  dépôt de couches par absorption UV et microbalance à quartz (QCM), la caractérisation d’une  inversion de charge au cours du dépôt LbL en utilisant des mesures de potential zêta, ou différentes  techniques d’imagerie telles que la microscopie électronique à balayage (SEM), la microscopie à  force atomique (AFM) ainsi que plusieurs tests d’activité spécifiques à une enzyme. 

Le  second  chapitre  passe  en  revue  l’utilisation  de  systèmes  d’administration  à  base  de  biopolymères destinés à l’administration intracellulaire de molécules siARN dans des cellules‐cibles. 

Les progrès récents en science des polymères ont conduit à un changement de paradigme,  selon  lequel on ne craint  plus que les biopolymères  souffrent  de propriétés mal définies et peu  reproductibles,  comme  auparavant,  permettant  ainsi  d’obtenir  des  biopolymères  de  qualité  pharmaceutique.  Plusieurs  biopolymères,  modifiés  ou  non,  possédant  des  propriétés  de  biocompatibilité  et  biodégradabilité  d’intérêt,  sont  discutés  en  tant  que  vecteurs  pour  l’administration de siARN. La biocompatibilité, une haute tolérabilité ainsi que la polyvalence de ces  biopolymères sont les principaux moteurs de l’intérêt que de nombreux groupes scientifiques  portent à ce type de système d’administration. Toutefois, la progression vers des essais cliniques  continue d’être retardée de façon significative. De notre point de vue, le plus important défi qui