Catalyse de l’étape réductase

En termes de catalyse, l’étape réductase étant rapide, cela implique une déprotonation de la Cys catalytique et une protonation de l’atome d’oxygène de la fonction sulfoxyde du substrat afin de faciliter l’attaque nucléophile du thiolate et la formation de l’état de transition de type sulfurane. Ceci doit se faire via un acide aminé accepteur et donneur de proton, éventuellement par un relais via une molécule d’eau. Les résultats cinétiques suggèrent que la Cys118 catalytique est activée lors de la formation du complexe Michaélien et que l’Asp143, qui se trouve sur brin "6, joue le rôle de catalyseur acide. En effet, la Cys118 doit être sous forme thiolate pour attaquer le soufre de la fonction sulfoxyde du substrat et comme le pKapp

de la Cys118 est de 8,5 dans l'enzyme libre, la liaison du substrat doit contribuer à la diminution de son pKapp, comme c’est d’ailleurs le cas pour les MsrA et MsrB. Ceci est en accord avec la structure cristalline du complexe enzyme-substrat dans laquelle, si la Cys118 est modélisée sous forme réduite, le thiolate peut adopter une orientation favorable pour attaquer l’atome de soufre du substrat et conduire à la formation d’un sulfurane avec les groupements SH et OH en positions apicales. De plus, le fait que le remplacement de l’Asp143 par une Ala ou une Asn conduise à une diminution drastique des constantes catalytiques, d’un facteur au moins 10² pour l’étape réductase et l’état stationnaire, suggère fortement un rôle de la fonction carboxylate du résidu Asp143 dans la catalyse de l’étape réductase (Fig. 50 page 95).

Figure 50: Mécanisme catalytique proposé pour l'étape réductase de la fRMsr (d’après Gruez et al., 2010a)

Le substrat se lie au site actif avec sa fonction sulfoxyde largement polarisée, conduisant à un état de transition compatible avec un sulfuranne de géométrie bipyramidale. Le réarrangement de l'état de transition conduit à la formation d'un intermédiaire acide sulfénique sur le résidu Cys118 catalytique et de Met. Dans ce scénario, le résidu Asp143 et une molécule d’eau (H₂O₉₉), elle-même liée par liaison hydrogène avec l'azote de la chaîne principale de la Ser119, stabilisent l'état de transition sulfuranne via des interactions avec le groupement OH, une situation semblable à celle décrite pour les MsrB.

Nos études ne permettent cependant pas de savoir si l’Asp143 participe, directement ou indirectement, à l’activation de la Cys118. En absence de substrat, le pKa de la Cys118 étant de 8,5, on peut exclure une interaction directe entre la Cys118 et l’Asp143. Ceci est en accord avec la structure tridimensionelle de l’enzyme de N. meningitidis en complexe avec le substrat qui montre une distance entre la Cys118 et l’oxygène de l’Asp143 qui semble incompatible avec une interaction directe entre les deux acides aminés. Par contre, l'oxygène du sulfoxyde interagit fortement non seulement avec l’Asp143 mais aussi une molécule d’eau (H₂O₉₉), qui forme elle-même une liaison hydrogène avec l'azote de la chaîne principale de la

Asp143 C Cys118 S O O O S CH₃ R S CH₃ R H " "" " + " "" " -Ser119 Asp143 C O O Ser119 Cys118 S O S R CH₃ " "" " -" "" " -" "" "+ H O₉₉ H H Asp143 C Cys118 S O O OH Ser119 H O₉₉ H

Ser119 (Fig. 51 page 96). Un scénario peut donc être proposé dans lequel le résidu Asp143 et la molécule d’eau doivent interagir non seulement avec l'oxygène de la fonction sulfoxyde sous forme polarisée, mais probablement aussi avec le groupement OH de l'état de transition sulfurane, et directement ou indirectement avec le groupement OH de l'intermédiaire acide sulfénique (Fig. 50). Il est intéressant de noter que la catalyse de l’étape réductase des fRMsr est semblable à celle des MsrA et MsrB, à l’exception de la nature des résidus qui interviennent, excepté bien sûr la Cys catalytique. En effet, les résultats obtenus par l’équipe montrent que dans les MsrA, le rôle de relais en tant que catalyseur acide serait assuré par le résidu Glu94 et que l’abaissement du pKapp de la Cys catalytique fait intervenir, de façon directe ou indirecte, non seulement ce résidu Glu mais également les résidus Tyr82 et Tyr134. Pour les MsrB, c’est un résidu His invariant qui joue le rôle de catalyseur acide et qui permet également l’abaissement du pKapp de la Cys catalytique dans le complexe enzyme-substrat. Ceci montre que différentes solutions ont été retenues au cours de l’évolution pour catalyser de façon efficace la réduction d’une fonction sulfoxyde par une Cys d’un site actif.

Figure 51 : Représentation en mode bâton du site actif de la fRMsr de N. meningitidis avec la L-Met-R-O fixée (d’après Gruez et al., 2010a).

Les atomes de carbone de la L-Met-R-O sont représentés en jaune, tandis ceux des acides aminés environnants sont en gris. Les atomes d’oxygène sont représentés en rouge, ceux d’azote en bleu et ceux de souffre en jaune. Les lignes pointillées indiquent les interactions polaires. Les molécules d'eau sont représentés en mode boule. Les résidus Pro82 et Cys84 sont présents dans deux conformations. La chaîne latérale de la Ser122 a été affinée en trois conformations. La chaîne latérale de l’Asp143 a été affinée en conformation double. La conformation mineure de la chaîne latérale de l’Asp143 (occupation 0,3) interagit avec la

molécule d’eau Wat125 qui pourrait interagir avec la chaîne latérale de la Cys118 après une simple rotation.