Caractéristiques des enhancers chez les ascidies

(9,5%) (Keys et al., 2005) Coexpression de gènes + Clusters de TFBS + conservation 23 <2 7 (30,4%) 6 (26,1%) (Johnson et al., 2005) Gènes co-exprimés + Clusters de TFBS + conservation 23 <1 10 (43,5%) 10 (43,5%) (Haeussler et al., 2010) Clusters de TFBS + conservation 20 <0,2 7 (35%) 4 (25%) (Khoueiry et al., 2010)

Tableau II.2 : Projets d’identification d’enhancers à l’échelle du génome. Combiner différentes méthodes pour identifier des enhancers augmente l’efficacité des prédictions (d’après Wang & Christiaen, 2012).

2. Caractéristiques des enhancers chez les ascidies

Les ascidies ont de petits enhancers (au moins pour ce qui est des enhancers minimaux) de l’ordre de quelques centaines de paires de bases, ce qui est généralement observé chez d’autres métazoaires (Levine, 2010). La dissection plus précise de certains enhancers par délétions successives a permis d’identifier des enhancers dits “minimaux” de 50 à 200pb contenant généralement des sites de fixation pour deux à quatre facteurs de transcription différents, actifs dans un seul ou quelques lignages cellulaires. Ces enhancers sont donc petits et relativement simples, comparés à la complexité combinatoire de la région cis-régulatrice d’Endo16 chez

l’oursin qui implique au moins 30 sites pour 13 facteurs de transcription ayant des rôles activateurs ou répresseurs (Yuh & Davidson, 1996).

Les séquences cis-régulatrices des ascidies semblent plus proches des gènes qu’elles régulent que chez d’autres espèces : les enhancers sont généralement présents dans les régions inter-géniques adjacentes et/ou dans le premier intron lorsque ce dernier est de grande taille. Ainsi, la majorité des enhancers connus sont localisés à moins de 3kb en amont du site d’initiation de la transcription (TSS), (Tableau II.3), mais seul un petit nombre d’enhancers a été pris en compte dans cette étude. Actuellement, on ne sait pas si des enhancers agissant à longue distance existent dans les génomes d’ascidies, les types d’expériences ayant permis de les identifier chez d’autres espèces n’ayant pas encore été réalisés chez les ascidies. La compacité du génome n’explique pas cette proximité gène-enhancer, car chez la drosophile qui a un génome de taille similaire, des enhancers ont été trouvés à 40kb du TSS (Kvon et al., 2014). Ainsi, les contraintes expliquant cette proximité seraient spécifiques aux ascidies : leurs génomes ayant été beaucoup réarrangés, il y a sans doute un avantage sélectif à avoir un enhancer localisé près du TSS (Irvine, 2013). Mais on peut également imaginer que c’est l’inverse : le génome a pu être extensivement réarrangé en l’absence d’éléments cis-régulateurs à distance, la probabilité de séparer un gène de ses régions régulatrices étant limitée.

Drosophila melanogaster * Ciona intestinalis ° Mus musculus°

Enhancers les plus distants du TSS 28% > 20kb, Jusqu’à plus de 100kb 12kb en amont 7,5kb en aval 123kb en amont 93kb en aval Distance médianes des enhancers au TSS 10kb 630pb en amont 2,4kb en aval >4,1kb en amont >6,3kb en aval

Tableau II.3 Les enhancers des ascidies sont plus proches des gènes qu’ils régulent que ceux des vertébrés et des drosophiles. Comparaison entre la Drosophila melanogaster, Ciona intestinalis et Mus musculus. (* Kvon 2014, ° Irvine 2013)

Les enhancers d’ascidies semblent avoir une architecture flexible et peu contrainte au sein et entre espèces, rendant difficile l’extraction des règles de la logique cis-régulatrice sous-jacente. Ainsi, au sein d’une espèce, des enhancers ayant le même profil d’activité, sont très variables en termes de composition, organisation et contribution à l’activité de l’enhancer de leurs TFBS

: la présence de sites de fixations pour au moins un des facteurs de transcription CRE, MyoD ou Tbx6 étant leur seul point commun (Figure II.8)(Brown, Johnson, & Sidow, 2007). Dans ce cas, l’organisation des enhancers orthologues est très similaire entre Ciona intestinalis et Ciona

savignyi.

S’ils ne présentent aucune conservation de séquence, les enhancer responsables de l’expression de Msxb dans le lignage de b6.5 chez Ciona intestinalis et Phallusia mammillata, conservent leur activité lorsqu’ils sont testés chez l’autre espèce (Roure, Lemaire, & Darras, 2014).

CRE MyoD Tbx6 Distance  au  TSS Nom du gène

Région en amont du TSS où se situent les enhancers

Figure   II.8   :   Les   enhancers   contrôlant  l’activité  de  gènes  dans   le   muscle   chez   Ciona   intestinalis   (Ci)   et   Ciona   savignyi   (Cs)   présentent   une   grande   variabilité   structurale,   mais   la   structure   d’enhancers   homologues   est   conservée   entre   les   deux  espèces.   Les  cercles   représentent  les  sites   de   fixation   pour   CRE   (rouge),   MyoD   (vert)   et   Tbx6   (bleu).   La   taille   des   cercles   correspond   à   la   contribution   relative   des   TFBS   à   l’activité   de   l’enhancer.  (Adapté  de  Brown  2007)

Les mêmes observations ont été faites chez Ciona intestinalis et Halocynthia roretzi pour les enhancers responsables de l’expression conservée d’Otx dans les lignages neuraux a et b (Oda-Ishii, Bertrand, Matsuo, Lemaire, & Saiga, 2005). Tous deux possèdent des sites de fixation pour Ets1/2 et GATA4/5/6, nécessaires pour l’induction d’Otx par FGF (Bertrand et al., 2003), mais le nombre, la distance et l’orientation relative de ces TFBS diffèrent entre les deux enhancers orthologues (Figure II.9) (Oda-Ishii et al., 2005).

Figure II.9 : Les enhancers d’Otx de Ciona intestinalis (Ci) et Halocynthia roretzi (Hr) ont une activité conservée en dépit de leur grande diversité structurale. Les lignes grises représentent les régions 5’ d’Otx. Les rectangles représentent les exons traduits (gris foncé) et non-traduits (gris clair). Les lignes bleues représentent les enhancers identifiées dans chaque espèce. Les lettres (A, a, B, b) représentent les lignages cellulaires où ces enhancers sont actifs. Les différents TFBS sont représentés par des ovales dont l’identité est définie par le code couleur en bas de la figure. Les astérisques indiquent les TFBS conservés entre Ci et Cs (Oda-Ishii et al., 2005).

De plus, dans le cas de l’enhancer neural d’Otx chez Ciona intestinalis, l’ordre, l’orientation et la distance entre les TFBS ne semblent pas contraints tant qu’au moins deux sites ETS et GATA sont présents et que deux TFBS sont séparés par au moins 5pb pour éviter l'encombrement stérique (Figure II.10) (Khoueiry et al., 2010).

Figure II.10 : L’enhancer neural d’Otx semble avoir une architecture flexible : l’orientation d’un site de fixation pour un facteur de transcription (TFBS) (A) ou la distance entre deux TFBS (B) ne semble pas avoir d’incidence majeure sur l’activité de l’enhancer tant que deux TFBS sont séparés par au moins 5pb. À gauche sont schématisées les versions de l’enhancer testées dans une construction rapporteur. À droite, les histogrammes représentent le pourcentage d’embryons où l’enhancer est actif dans les précurseurs neuraux (Khoueiry et al., 2010).

Ces résultats suggèrent une flexibilité structurale de type “panneau d’affichage” (billboard) (Arnosti & Kulkarni, 2005; Spitz & Furlong, 2012). De tels enhancers serait donc plus difficiles à prédire sur la base de règles syntaxiques précises.

Mais ce n’est pas le cas pour tous les enhancers de Ciona intestinalis : une approche similaire a été menée par Passamaneck et ses collègues pour comprendre l’organisation des sites de fixation de Brachyury et FoxA-a dans l’enhancer activant l’expression de Tune dans la notochorde. La très grande majorité des modifications de l’organisation intrinsèque des TFBS diminuent ou annihilent l’activité de l’enhancer (Passamaneck et al., 2009) (Figure II.11). Si plusieurs signatures de l’activité enhancer ont été identifiées, la compréhension de leur logique n’est pas suffisante pour prédire la présence d’enhancers à partir de la seule séquence de l’ADN génomique.

Dans la prochaine partie, je présenterai l’élément a, que j’ai utilisé pendant ma thèse comme enhancer-modèle pour mieux comprendre la logique de l’architecture d’un enhancer.

A.  Orientation  des  TFBS

B.  Distance  entre  les  TFBS

Site  de  fixation  pour   ETS

Site  de  fixation  pour   GATA