CHAPITRE IV : INFLUENCE DES NEURONES SENSORIELS SUR LA REEPITHELIALISATION
4.1.5 Caractéristique histologique de l’effet du glyoxal sur les plaies reconstruites
L’effet du glyoxal sur la structure histologique des plaies a été regardé après coloration au trichrome de Masson, lorsque l’expérience fut terminée (Fig. 35). Les plaies des contrôles avec et sans neurones à 12 jours sont toutes les deux refermées. L’épiderme du contrôle avec neurones semble légèrement plus épais par rapport au contrôle sans neurones. De plus dès le jour 4 les kératinocytes semblent avoir déjà recouverts le lit de la plaie alors que dans les conditions G500 avec ou sans neurones il semble y avoir une mortalité importante au niveau des kératinocytes. Dans la condition G500 avec neurones, au jour 12 la dégradation de l’épiderme a été observée, par ailleurs le derme semble en état de stress (Fig.35).
4.2 Discussion
4.2.1 Comparaison histologique de peaux de patients diabétiques versus des
peaux normales humaines
Lorsque les histologies sont comparées entre les peaux normales humaines et les peaux de deux types diabétiques, 1 et 2, dans la figure 30, il semble y avoir peu de différence entre les histologies de peau diabétique de type 1 et la PNH, de même que pour l’histologie de peau diabétique de type 2, H76T2. En revanche, le deuxième échantillon de peau de type 2 provenant
Figure 35 : Comparaison des structures histologiques des modèles 3D de guérison des plaies avec et sans traitement au G500
77 d’un autre patient, H72T2, un épaississement de l’épiderme est observé, ainsi qu’une mauvaise différenciation car il semble avoir présence de cellules nucléées au niveau supérieur de la couche cornée de l’épiderme, ce qui n’est pas retrouvé dans les autres peaux diabétiques ni dans la PNH. Au niveau de la peau H72T2, un phénotype particulier représentant des invaginations de la jonction dermo-épidermique a été observé. Ce phénotype pourrait être dû a une coupe trop tangentielle du tissu ou à la glycation liée à l’hyperglycémie du patient. D’autre facteurs peuvent également rentrer en compte, il serait intéressant de recouper le tissu, et d’avoir un échantillonnage de biopsie de peau des deux types diabétique plus important pour permettre de mieux déterminer la cause de ce changement de structure au niveau de l’épiderme.
4.2.2 Effet de la glycation sur la prolifération des cellules endothéliales
La glycation est un processus qui induit la formation d’AGE. Ces AGEs peuvent agir directement sur les cellules en se fixant à leurs récepteurs, RAGE, situé à la surface des cellules. RAGE est un récepteur connue pour activer l’expression de différentes molécules participant à la réponse inflammatoire ainsi qu’à des dommages tissulaires [162]. L’effet direct des AGEs reste peu connu, seules certaines études ont montrées qu’ils pouvaient induire l’apoptose des fibroblastes [163] et auraient également un effet sur le cytosquelette des fibroblastes [164]. Néanmoins l’utilisation du glyoxal est délicate car la ligne qui sépare l’effet induit par la production d’AGEs, et l’effet induit par la cytotoxicité du produit est mince. Il est donc important d’optimiser et de déterminer quelle serait la meilleure concentration de glyoxal sur les cellules. Les cellules qui seront testé en présence du glyoxal sont les cellules endothéliales, les fibroblastes, les kératinocytes et les neurones sensoriels. Tout d’abord, l’effet de la glycation induit par plusieurs concentrations de glyoxal a été observé au niveau des cellules endothéliales. Suite aux traitements avec trois concentrations de glyoxal différentes, 200µM (G200), 300µM (G300) et 500µM (G500), la figure 31 montre une diminution significative de la prolifération des cellules endothéliales allant d’une diminution d’environ 25% pour G200 et jusqu’à 50% de diminution pour les traitements G300 et G500. Lors des traitements avec le glyoxal combiné
avec deux concentrations de SP, 10- 6M et 10- 7M, aucune augmentation de la prolifération n’a été
remarquée pour G300 et G500 par rapport au traitement seul. Néanmoins, pour le traitement
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de 25% de la prolifération des cellules endothéliales a été observée avec SP à 10-7M par rapport
au traitement avec G200 seul, ceci correspondant à une prolifération similaire au contrôle. La SP est un neuropeptide connu pour son influence plus ou moins importante sur la migration et la prolifération des cellules endothéliales [165, 166]. Lorsqu’il est ajouté au traitement au glyoxal, il semblerait permettre un effet compensatoire sur les cellules endothéliales avec une concentration de G200. Il est probable qu’avec une concentration plus élevée, cet effet ne serait pas remarqué, car le glyoxal deviendrait cytotoxique pour les cellules endothéliales. Pour vérifier ces hypothèses il faudrait comparer ces résultats avec un test de cytotoxicité sur une culture monocouche de cellules endothéliales.
4.2.3 Influence de la glycation sur la guérison des plaies
Les neurones sensoriels, ainsi que les neuropeptides libérés par ces derniers, permettent une bonne guérison des plaies, ainsi qu’un remodelage adéquat des tissus [29, 167]. Dans le cadre de pathologie comme le diabète, l’hyperglycémie entraine des complications comme des neuropathies, entrainant à leurs tours une mauvaise guérison des plaies amenant parfois à l’infection des tissus et à l’amputation. Ces neuropathies sont induites par les produits de glycation formés. Le traitement des DRG avec du glyoxal entraine la formation d’AGEs comme le CML mais ne semble pas entrainer de neurotoxicité [168].
Plusieurs concentrations de glyoxal ont été utilisées sur le modèle de guérison de plaies pour optimiser au mieux ce modèle dans un contexte glyqué afin de permettre au glyoxal d’entrainer la glycation des protéines sans induire de cytotoxicité. Des tests préliminaires sur des cultures en monocouches des différents types cellulaires présents dans le modèle, kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales et neurones sensoriels, ont été effectués par notre équipe, permettant de faire ressortir trois concentration de glyoxal entrainant la production d’AGEs au niveau de ces cellules. Ces concentrations sont G200, G300 et G500. Au-delà de G500 il y a une mortalité cellulaire importante et en dessous de G200, le glyoxal n’a pas ou peu d’influence sur la production d’AGEs. De plus il a été remarqué qu’étant donné que le glyoxal se dégrade au fur et à mesure du temps et que les changements de milieux sont faits au deux jours, un léger effet réversible a été observé au niveau du modèle. Par ailleurs, la production de CML par les cellules
79 est différente si les éponges sont cultivées en immersion ou en interface air/liquide dans un milieu contenant du glyoxal. Il est ressorti que lorsque le modèle de guérison de plaies est traité avec du glyoxal air/liquide, il y a un ralentissement de la fermeture des plaies mais pas un blocage complet, alors que lorsque le modèle est préalablement placé en immersion dans un milieu contenant du glyoxal, puis en interface air/liquide, une interruption total de la fermeture des plaies à été observée (Fig. 33).
La vitesse de migration des kératinocytes présentée dans la figure 32 montre que le traitement avec du G200 et du G300 diminue de près de 60 % la vitesse de réépithélialisation. Nous avons déjà montré que l’ajout de neurones sensoriels dans notre modèle de guérisons des plaies augmentait de manière significative la vitesse de réépithélialisation [109]. Néanmoins les résultats obtenus dans la figure 32 ne montrent pas de différence entre le contrôle et le contrôle innervé, ce qui laisserait penser qu’il y aurait pu avoir un mauvais ensemencement des DRG, ou que les DRG obtenue ont eu un taux de mortalité important entre le moment de l’extraction et l’ensemencement des cellules. Dans la figure 33 on observe que l’innervation du modèle de guérison de plaies lors du traitement avec G300 semble avoir un effet positif. Néanmoins, il faudra vérifier et confirmer ces résultats avec une autre expérience et en augmentant le nombre de nos échantillons.
4.2.4 Expression de CML dans la guérison des plaies
Le CML est un AGE qui est produit suite à la glycation des protéines. Pour vérifier que la glycation atteint les cellules, lors de l’expérience préliminaire de guérison des plaies, des marquages de CML ont été fait à deux temps, au jour 4 et au jour 12 après que la plaie est été faite (Fig. 34).
Les immunofluorescence montrent que le CML est présent seulement dans les échantillons de plaies qui ont été traités avec du glyoxal à 500µM. Il y a peu de différence microscopique entre le jour 4 et le jour 12 pour l’expression du CML. De même que pour la présence de neurones sensoriels ou non. En revanche, dès le jour 4 de traitement avec le glyoxal à 500µM, toutes les cellules épidermiques sont mortes.
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83 Ces études montrent que lors de l’inflammation neurogène suite à une lésion, les neurones sensoriels vont détecter le stress causé au tissu, entrainant ainsi la libération en grande quantité de deux neuropeptides principaux, la SP et le CGRP. Les récepteurs spécifiques de ces neuropeptides, Nk1 ainsi que RAMP1 et CLRL pour la SP et le CGRP respectivement sont exprimés au niveau du derme par les fibroblastes et les cellules endothéliales. Les neurones sensoriels vont ainsi favoriser la formation de CLT via la libération des neuropeptides et plus particulièrement de la SP qui semble intervenir de manière directe sur l’augmentation de la migration des cellules endothéliales.
D’après nos résultats, il semblerait que les neuropeptides puissent de manière indirecte favoriser l’angiogenèse, en activant les fibroblastes, via leurs récepteurs spécifiques situés à la surface de ces derniers, induisant ainsi la sécrétion de NGF par les fibroblastes. Par ailleurs, nous avons confirmé que le NGF était une neurotrophine importante dans l’angiogenèse, en effet, lorsque celui-ci est inhibé une diminution de la formation des CLT est observée.
De plus, la SP à une concentration de 10- 7M semble induire dans le derme reconstruit la sécrétion de VEGF. Par ailleurs, le VEGF est également sécrété en quantité importante par les fibroblastes dans la condition contrôle du modèle 3D. Il serait intéressant de vérifier sur une culture monocouche de cellules endothéliales, si celle-ci sécrète elle-même le VEGF et si une diminution de la migration et de la prolifération des cellules endothéliales est observée lors de l’utilisation d’un antagoniste bloquant le récepteur au VEGF, cette hypothèse pourra être vérifiée par ELISA.
Dans le cadre du diabète, la glycation induit par l’hyperglycémie peut entrainer un état de stress au niveau des cellules cutanées. In vitro, nous avons montré que l’induction de la glycation par l’intermédiaire d’un traitement avec du glyoxal sur un modèle de guérison de plaies reconstruit par génie tissulaire ralentis, voir arrête complètement, la réépithélialisation. Les kératinocytes ne sont plus capables de proliférer et de migrer. Par ailleurs nous avons montré que la prolifération des cellules endothéliales diminuait avec le traitement au glyoxal. Néanmoins cet effet négatif a pu être compensé par l’addition de SP dans le milieu en combinaison avec le traitement au glyoxal.
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De plus, les neurones sensoriels ajoutés aux échantillons traités semblent favoriser la réépithélialisation, néanmoins les résultats obtenus ne sont pas significatifs, l’expérience est à renouveler pour confirmer ce résultat. Par ailleurs, l’expression du CML dans le modèle de peau reconstruite, montre que nous pouvons induire la glycation sans effet cytotoxique, en adaptant la concentration du glyoxal et les temps de traitement. A forte concentration, le glyoxal entraine des dommages important au niveau de la structure de l’épiderme in vitro, dans le modèle de guérison des plaies, le tissu semble désorganisé par rapport au contrôle.
En conclusion, dans le cadre de l’inflammation neurogène, la substance P semble être un neuropeptide essentiel puisqu’il favorise plusieurs mécanismes, il semble avoir un effet positif dans la guérison des plaies en contexte sain et glyqué et il est impliqué dans l’angiogenèse de manière directe et indirecte.
En perspective, il serait pertinent de refaire l’expérience sur la formation de CLT en modèle 3D, en augmentant notre nombre d’échantillons, et en confirmant la quantité de protéines obtenues par prélèvement des différents surnageants tout en broyant la matrice de collagène synthétique. Pour s’assurer de l’influence des neurones sensoriels dans chacune des conditions avec traitements, il faudrait faire un compte du nombre de neurones présents à la fin de l’expérience dans les échantillons et les comparer au contrôle innervé sans traitement. Vérifier l’implication d’autre neuropeptides comme PACAP et VIP serait intéressant, pour s’assurer de l’effet unique ou non de la substance P. Dans le cadre de la guérison des plaies dans un contexte diabétique, grâce à l’extraction de cellules de patients diabétiques de types I ou II, il serait pertinent de reproduire notre modèle et toutes les expériences précédentes avec ces cellules de patients plutôt qu’avec des cellules de sujets sains, pour vérifier le phénotype de ces cellules, et de comparer les résultats avec notre modèle de glycation actuel.
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