Caractérisation moléculaire de la structure et de l’état physiologique des populations d’E col

- Structure des populations d’E. coli dans les différents compartiments du bassin versant. Différentes techniques telles que l’électrophorèse enzymatique multilocus

(MLEE)120, les méthodes d’amplification aléatoire du polymorphisme de l’ADN (comme la box- , rep- , ERIC- PCR, et RAPD121;122;123 ou l’électrophorèse en champ pulsé (PFGE124)

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Pavé A. 1994. Modélisation en Biologie et en écologie, 559p. Aléas Ed, Lyon

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sont utilisées pour analyser et comparer la diversité des populations naturelles d’E. coli dans différents compartiments environnementaux du site d’étude. Ces approches nécessitent toutefois l’isolement préalable des bactéries sur milieux gélosés (approches par isolats) et sont donc fastidieuses et ne permettent pas de tenir compte de l’ensemble de la diversité des populations ciblées.

- Dans ce travail nous avons choisi d’utiliser une technique permettant d’obtenir et comparer les empreintes moléculaires (ou ‘fingerprints’) des populations d’E. coli dans les différents compartiments du système bassin versant. Il s’agit de la DGGE ciblant le gène uidA125. Le principe de la méthode repose sur la séparation (en fonction de la variabilité de leurs séquences et notamment de leurs pourcentages GC) d’amplicons sur un gel d’acrylamide contenant un gradient dénaturant. Pour les populations d’E. coli, le fragment amplifié correspond à un fragment interne de 168 pb du gène uidA.

- La première étape limitante de cette méthode est d’extraire à partir des échantillons un ADN total en quantité suffisante, de bonne qualité (non dénaturé) et pur (absence de contaminations par des acides humiques pour les échantillons sols qui sont un frein aux amplifications PCR). Au cours de ce travail plusieurs méthodes d’extraction et de purification d’ADN (kits FastDNA SPIN de BIO101 systems, Qbiogene et PowerSoil de Mobio, utilisation de colonnes de PVPP) ont été testées. Les plus grandes difficultés sont rencontrées avec les échantillons de sol car les amplifications PCR uidA réalisées sur ce type d’échantillon se sont avérées insuffisantes. Ceci est probablement lié aux faibles niveaux des populations d’E. coli dans les sols. Pour pallier ce problème, des étapes d’enrichissement (cultures en milieu) sont réalisées.

- La structure des populations d’E.coli avant et après enrichissement a pu être comparée, en ce qui concerne les échantillons d’eau et de bouses. Les modifications de structure des populations observées, en particulier dans les échantillons de bouses, mettent en évidence l’existence de (sous)populations d’E.coli non- cultivables dans ces échantillons. C’est donc la structure des populations d’E.coli cultivables (i. e. après enrichissement) que nous avons comparée dans ce travail.

- En parallèle, une approche complémentaire de clonage/séquençage est développée afin d’étudier le polymorphisme du gène uidA dans les populations des différents compartiments du bassin versant. Pour ce faire, des amplicons uidA sont générés à partir d’échantillons d’ADN total ou d’isolats d’E.coli. Ces amplicons sont clonés dans le vecteur pGEMT- Easy puis séquencés en utilisant des amorces universelles M13Forward et M13Reverse. Ces séquences sont analysées et un arbre phylogénétique construit (par Neighbour joining) en utilisant le logiciel Mega 31.

- En ce qui concerne les STEC, la diversité des isolats collectés au cours des 2 saisons de pâturage est analysée par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). Cette méthode permet de révéler les liens de clonalité entre des isolats par comparaison de leur pulsotype (c’est- à- dire du profil de digestion de l’ADN génomique par une ou plusieurs enzymes de restriction). Ici, nous utilisons l’enzyme XbaI. Les profils de virulence des isolats sont caractérisés par amplification PCR des gènes stx1, stx2, eae et ehx. D’autres caractéristiques phénotypiques sont également étudiées (sérotypes, mobilité, aptitude à former des biofilms).

- Analyser l’état physiologique des E. coli . Notre objectif initial est de déterminer et

comparer l’état physiologique (état de division ou de dormance) dans lequel se trouvent les

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Lu L., M. E. Hume, K. L. Sternesand S. D. Pillai. 2004. Genetic diversity of Escherichia coli isolates in irrigation water and associated sediments : implications for source tracking. Water Res. 38 : 3899- 3908. 125 _{Sigler W. V. and L. Pasutti. 2006. Evaluation of denaturing gradient gel electrophoresis to differentiate E. coli} communities in secondary environments. Environ. Microbiol. 8 : 1703- 1711.

populations d’E. coli et les populations de Pseudomonas fluorescents (i) dans les différents compartiments du bassin versant et (ii) en fonction des saisons (pendant la période de pâturage, l’hiver). Dans la littérature, aucune méthode permettant d'appréhender l'état physiologique des bactéries dans le sol n'est disponible. Des mises au point méthodologiques ont donc dues être entreprises pour tester la faisabilité de cette approche.

- Comme nous l’avons précédemment décrit (voir § 3. 3), certains gènes chez les bactéries sont spécifiquement transcrits in vitro au cours des phases exponentielle ou stationnaire de la croissance bactérienne. Nous avons choisi de travailler sur 3 marqueurs de phase exponentielle rpoZ, fis et ftsZ et 3 marqueurs de phase stationnaire rpoS, rmf et dps, pensant que l'analyse de l'expression de ces 6 marqueurs dans un même échantillon nous permettrait de définir l'état physiologique d'E.coli. Etant donné que la transcription de ces marqueurs n’a, à notre connaissance, jamais été étudiée in situ, il s’est avéré nécessaire de vérifier l’expression de ces marqueurs moléculaires au cours de cinétique de croissance d’E. coli dans des systèmes simplifiés, à savoir des microcosmes de sol inoculés.

- Une souche E. coli DH5α est utilisée comme souche de laboratoire témoin. Plusieurs souches environnementales isolées dans le bassin versant sont utilisée: (i) dans une bouse, dans les sols rhizosphériques (ii) sous Poa et (iii) sous Rumex. Ces souches sont isolées après culture sur MUG- Ec agar. L’appartenance de ces souches à l’espèce E. coli est confirmée par croissance sur milieu TTC- Tergitol7 à 44°C, par galerie API- 20E et par séquençage d’un fragment du gène uidA. Après tamisage des sols à 2 mm, des. A partir de précultures de nuit (les cellules sont lavées dans du NaCl à 0,8% et mises en suspension dans du tampon phosphate), des microcosmes d’environ 10g de sol humide sont inoculés avec 5. 108 cellules d’E. coli. Trois microcosmes sont préparés par type, de sol, de temps d’échantillonnage et de souche. De façon à simuler l’alternance des températures existant entre le jour et la nuit, les microcosmes sont incubés quotidiennement 12h à 20°C et 12h à 4°C. Les microcosmes sont analysés aux temps 0h, 3h, 18h, 24h, 48h, 7 jours (168h), 10 jours (240h), 14 jours (336h), 28 jours (672h) et 60 jours (1440h). Une bouse fraîche mélangée à du sol rhizosphérique sous Poa ou Rumex (50% bouse fraîche/50% sol) complète le dispositif expérimental.

- La croissance des souches d’E. coli est suivie par énumération des E. coli sur milieu TTC- tergitol7 agar, à 44°C. En parallèle, les ARNs sont extraits à partir de 0,5 g de sol équivalent sec avec des billes de zirconium, dans un tampon de lyse. Suite au broyage, les protéines sont éliminées par un traitement avec un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24/1 (V/V) et les acides nucléiques sont précipités avec de l’isopropanol à température ambiante. Les ARNs sont purifiés sur colonne (RNeasy mini kit, Qiagen) et traités deux fois avec une DNase (Ambion) afin d’éliminer toute traces d’ADN. Les ARNs extraits sont alors déposés sur gel d’agarose 1,2% afin de vérifier leur pureté, dosés au Nanodrop ND1000 et une PCR sur le gène rrs avec les amorces universelles pA/pH (référence) est effectuée afin de vérifier l’absence de toute trace d’ADN. Les ARNs purs sont rétrotranscrits aléatoirement avec le kit ImPromII™ Reverse Transcription System (Promega) afin d’obtenir des ADNc.

- Les gènes cibles sont ensuite amplifiés par PCR semi- quantitatives avec des amorces spécifiques mises au point dans le cadre de ce projet. Les PCR sont réalisées sur une quantité fixe d’ADNc (50 ng). Les amplifiats (5 µl) obtenus après différents cycles d’amplification sont déposés sur gel d’agarose. Pour un nombre de cycles identiques situés dans la zone d’augmentation linéaire de l’amplification, l’intensité des signaux obtenus pour chaque marqueur est comparée sur l’ensemble des échantillons extraits au cours du temps.

- En ce qui concerne, les amorces spécifiques d’E. coli et de Pseudomonas spp., ces dernières sont définies sur la base d’alignements multiples (en utilisant le logiciel ClustalW) des séquences de ces différents marqueurs chez différentes subdivisions des protéobactéries (utilisation de la base de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI)). Des analyses phylogénétiques de ces différents marqueurs sont menées en parallèle en utilisant le logiciel MEGA3. 1126. Après la définition des amorces, les protocoles PCR sont établis sur 11 souches d’E coli isolées dans l’eau de l’alpage de Bise en 2004 et sur la souche DH10B d’E.coli K- 12.

- Pour les amorces ciblant les Pseudomonas spp., les protocoles sont tout d’abord élaborés à partir de souches de Pseudomonas fluorescens (PITR2, CM1a2, F113, P97- 30, K94- 31, CHA0, PILH1, P97- 26) puis testés sur d’autres espèces de Pseudomonas spp. (P. syringae pv syringae, P. syringae pv aptata, P. aeruginosa PA01, P. alcaligenes, P. asplenii, P. chlororaphis, P. citronellolis, P. fragilis, P. pseudoalcaligenes, P. stutzeri, P. viridiflava).

- La spécificité des amorces fait l’objet d’un test sur des souches d’espèces proches phylogénétiquement d’E.coli (Pectobacterium carotovorum, Erwinia chrysanthemi, Proteus mirabilis, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Enterobacter aerogenes et Serratia marescens) et de Pseudomonas spp. (B. cenocepacia, Ralstonia solanacearum GMI1000 et Acinetobacter calcoaceticus).