Caractérisation de l’Ag 3D9

1. ELISA

a. Immobilisation de l'Ag et saturation

Cent microlitres d’extraits antigéniques bruts, d’extraits prépurifiés ou d’extraits purifiés dilués en tampon carbonate-bicarbonate de sodium 0,05 M pH 9,6 ont été distribués dans chaque puits de plaques pour microtitration Polysorb (Greiner). Après 1 h 30 d’incubation à 37°C, les puits ont été lavés avec 250 µl de PBS. La saturation des puits a été réalisée avec 250 µl de PBS-lait écrémé 10 % (Régilait ) par puits pendant 18 h à 4°C.

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b. Détection immunologique

Après 3 lavages avec 250 µl de PBS-Tween 0,5 ‰, 100 µl d’AcM 3D9.3 (30 µg/ml), d’AcM C7 ou d’AcM 5B2 dilués en PBS ont été déposés et laissés 1 h à 37°C. Les puits ont été à nouveau lavés 3 fois avec 250 µl de PBS-Tween 0,5 ‰ puis 100 µl d’anticorps de chèvre anti-IgM (µ-spécifique) de souris marqués à la peroxydase du raifort (Caltag), dilués au 1/2 000 en PBS-Tween 0,5 ‰-lait 1 %, ont été déposés et incubés pendant 1 heure à 37°C. Trois lavages avec 250 µl de PBS-Tween 0,5 ‰ ont été effectués puis la révélation a été réalisée par addition dans chaque puits de 200 µl d’une solution de tampon citrate-phosphate

0,15 M pH 5, contenant le chromogène (orthophénylène-diamine) et le substrat (H₂O₂). Après

25 min d’incubation à température ambiante et à l’obscurité, la réaction enzymatique a été arrêtée par addition de 50 µl d’acide sulfurique 1 M. La lecture des densités optiques a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre (Elx800, Bio-Tek instruments) à 492 nm.

2. Immunofluorescence indirecte (IFI) a. Préparation des lames

Vingt microlitres d’une suspension de tubes germinatifs fraîchement préparés de

diverses souches de C. albicans ou de S. cerevisiae ont été déposés dans chaque puits à raison

de 10⁷ cellules/ml. Après fixation par séchage, les lames ont été conservées à –20°C.

b. Révélation

Vingt microlitres d’AcM 3D9.3, C7 ou 5B2 purifiés dilués ou non en PBS ont été déposés par puits de lame pour immunofluorescence. Après 1 heure d’incubation à 37°C en chambre humide, les lames ont été lavées pendant 8 min avec du PBS puis séchées. Ensuite, 20 µl d’anticorps de chèvre anti-IgM (µ-spécifique) de souris, couplés à l’isothiocyanate de fluorescéine (Caltag), dilués au 1/300 en PBS, ont été déposés dans les puits. Après incubation d’1 h à 37°C en chambre humide, les lames ont été lavées pendant 8 min avec du PBS, puis séchées et enfin montées en glycérine tamponnée (9 volumes de glycérol pour 1 volume de PBS). L’observation a été réalisée avec un microscope équipé pour l’examen en épifluorescence (Nikon Fluophot).

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3. Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de Dodécyl Sulfate de Sodium (SDS-PAGE)

Les constituants contenus dans les extraits fongiques (bruts, prépurifiés, purifiés) ont été séparés en fonction de leur masse moléculaire. La migration a été réalisée sous réfrigération, à voltage constant (300 V) et à ampérage variant de 80 mA en début de migration et 10 mA en fin de migration pendant 3 h environ (système HOEFER SE 600 Ruby). Une concentration en polyacrylamide de 4 % pour le gel d'empilement et des gels de séparation en gradient de 5 à 15 % ont été utilisés.

Coloration des gels de polyacrylamide

Pour la coloration au bleu de Coomassie, après séparation électrophorétique, les gels ont été fixés pendant 1 h à l'aide d'un mélange isopropanol-acide acétique (25 %-10 %), puis colorés au bleu de Coomassie à 0,025 % dans un mélange méthanol-acide acétique (40 %-7 %). Le gel a été ensuite décoloré par bains successifs dans un mélange méthanol-acide acétique (40 %-7 %).

Les gels de polyacrylamide ont également été colorés au Nitrate d’argent. Le protocole de cette coloration est présenté en annexe.

L’acquisition des images a été réalisée grâce au logiciel Biocapt (Vilbert Lourmat, France) et l'analyse des profils électrophorétiques a été réalisée grâce au logiciel Bioprofil ID (Vilbert Lourmat, France).

4. Electrotransfert, immunodétection et affinodétection a. Electrotransfert semi-sec

Après séparation par SDS-PAGE, les constituants ont été transférés sur une membrane

d’Immobilon (Millipore) selon le protocole établi par Twobin et al. (284). Cette membrane

a d'abord été réhydratée par passage pendant quelques secondes dans un bain de méthanol, dégraissée pendant 10 min dans une solution de Tween 20 à 5 % puis lavée avec de l’eau distillée. La membrane a été ensuite équilibrée avec le tampon de transfert puis placée sur 3 épaisseurs de papier Whatman saturé du même tampon. Le gel, préalablement équilibré avec le tampon de transfert, a été disposé sur la membrane et recouvert de 2 épaisseurs de papier Whatman également saturé. Le transfert a été réalisé à 2,5 mA/cm² de gel et à voltage limité à 45 V pendant 1 h (système SEMI-BLOTTER II TEBU). Après transfert, la partie de

59 la membrane sur laquelle se trouvent les marqueurs de masse moléculaire a été découpée puis colorée pendant 10 min dans une solution d’amidoschwarz à 0,1 %. La décoloration a été réalisée par un mélange méthanol-acide acétique (40 %-7 %).

b. Immunodétection

Après transfert, la membrane a été saturée avec une solution de lait écrémé (Régilait ) à 10 % dans du PBS pendant 18 h à 4°C puis rincée en PBS-Tween 0,5 ‰. La membrane a été incubée pendant 1 h à température ambiante avec l’AcM 3D9.3 à une concentration de 100 µg/ml en PBS, avec l’AcM C7, avec l’AcM 5B2 ou avec le sérum anti-Als3p dilué en PBS. Après 3 lavages avec du PBS-Tween 0,5 ‰, la membrane a été incubée avec une solution d’anticorps de chèvre anti-IgM (µ-spécifique) de souris couplés à la peroxydase (Caltag) ou avec une solution d’anticorps de chèvre anti-IgG (H+L) de lapin couplés à la peroxydase (Caltag) dilués au 1/300 en Tween 0,5 ‰-Lait 1 %. Après 3 lavages en PBS-tween 0,5 ‰, la révélation a été réalisée grâce à un chromogène, la 3,3’diaminobenzidine (DAB) en solution dans un tampon Tris-HCl 0,1 M pH 7,6 en présence d’eau oxygénée. La réaction a été arrêtée avec une solution d’acide acétique à 5 %.

Pour certaines expériences, la révélation a été réalisée grâce à une méthode plus sensible : l’électrochemoluminescence (ECL). Deux kits ont été utilisés, l’Uplight One Spray

(Interchim) et l’ECL Advancetm

Western Blotting Detection Kit (Amersham). La révélation a été effectuée en respectant le protocole décrit par chaque fournisseur.

c. Affinodétection par la Concanavaline A

Après transfert, la membrane a été saturée avec une solution de Bovine Serum Albumin (BSA) à 3 % dans du PBS pendant une nuit à 4°C puis rincée avec du PBS-Tween 0,5 ‰. La membrane a été incubée pendant 1 heure à température ambiante avec une solution de Concanavaline A (ConA)-peroxydase (6 µg/ml) (Sigma) diluée dans du PBS contenant 0,1

mM de Ca²⁺ et 0,1 mM de Mg²⁺. La révélation de l'activité peroxydase a été réalisée suivant

le protocole décrit dans le paragraphe précédent.

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5. Electrophorèse bidimensionnelle

Cent cinquante microgrammes de protéines contenant l'Ag 3D9 issus de la chromatographie d’exclusion/diffusion ont été lyophilisés et repris par 250 µl de solution de réhydratation contenant de l’urée 6 M, du thio-urée 2 M, 4 % de 3-[(3-Cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1 % de Dithiothreitol (DTT), 0,5 % d’Immobiline pH Gradient (IPG) Buffer (Amersham Biosciences) et du bleu de

Bromophénol. Cette solution a été ensuite déposée dans un sarcophage

d’isoélectrofocalisation recouvert par une Immobiline DryStrip pH 3-10 de 13 cm (Amersham Biosciences) et de l’IPG cover fluid. L’isoélectrofocalisation a été réalisée grâce à l’Ettan™ IPGphor™ II IEF System (Amersham Biosciences) après une réhydratation de 12 h suivie d’une isoélectrofocalisation par gradient de voltage allant de 200 à 8000V pour 50 µA par Strip.

La migration en deuxième dimension a été réalisée par SDS-PAGE avec un gel en gradient de polyacrylamide de 5 à 15 %. Les Strip ont été incubés dans une solution d’équilibration, déposés en haut du gel d’acrylamide puis recouvert par une solution d’agarose. La migration a été réalisée selon le protocole décrit précédemment. Le gel a été utilisé pour effectuer un électrotransfert suivi d’une immunodétection avec l’AcM 3D9.3.