Caractérisation du recrutement de dFMRP dans les GS

Le dynamisme de dFMRP dans les granules-dFMRP que nous avons montré dans les expériences précédentes nous a incités à étudier la possibilité que dFMRP pourrait aussi être dynamique dans les GS.

Pour répondre à cette question, nous avons d'abord analysé la localisation de la GFP- dFMRP dans SG lors du traitement à l’arsénite (figure 3.17). Afin de tester la contribution de chaque domaine de la protéine dFMRP et son potentiel de trafic entre les GS et le cytoplasme, nous avons aussi inclus des mutants dFMRP dans cette analyse. Les cellules de drosophiles ont été transfectées avec GFP-dFMRP, traitée avec arsénite, et la localisation de protéines de fusion GFP dans SG est ensuite mesurée par des anticorps qui sont aussi des marqueurs de GS : anti-dFMRP (figure 3.17.A), et anti-deIF4E, anti- dPABP (figure 3.17.B), ainsi que les ARNm poly (A) + (Figure 3.18.A). Comme nous l’avons déjà indiqué, la GFP-dFMRP et ses mutants KH et RGG se localisent dans les granules qui sont reconnues par les anticorps anti-dFMRP (figure 3.17.A) et à la fois anti-deIF4E et anti-dPABP (figure 3.17.B) dans la majorité des cellules transfectées. Ces granules contiennent également les ARNm poly (A) + comme le montre l’expérience FISH en utilisant une sonde oligo (dT) (figure 3.18.A). La quantification du signal des ARNm-poly (A) + (figure 3.18.B) a montré que la quantité de l'ARNm dans les granules varie de ~ 60 % pour le mutant RGG et ~ 70 % dans les cellules exprimant la GFP- dFMRP ou le mutant GFP-KH. Cependant, ces expériences n'ont pas pu déterminer si les granules détectées représentent les GS induites par arsénite ou simplement des granules-dFMRP induites par l’expression de GFP-dFMRP et ses mutants avant d'ajouter

57 l'arsénite. Il est important de distinguer entre ces deux possibilités afin de déterminer si la protéine exprimée GFP-dFMRP est incorporée dans les nouvelles GS.

Des résultats plus clairs ont été obtenus en utilisant le mutant PP qui, comme nous l'avons décrit précédemment n'induit pas la formation des granules-dFMRP et reste plutôt diffus et réparti uniformément dans le cytoplasme des cellules non stressées. Nous avons aussi constaté que ce mutant PP est efficacement recruté les GS induites par arsénite avec dFMRP endogène (figure 3.17.A), à la fois deIF4E et dPABP (figure 3.17.B), et avec les ARNm poly (A) + (figure3.18.A). Ce résultat montre que le domaine PP de la protéine dFMRP n’est pas important pour la localisation de la protéine dans les GS induite par l'arsénite. L’expression du mutant PP ne semble pas affecter le niveau des ARNm dans les GS, étant donné qu'un pourcentage similaire de ARNm poly (A) + (~ 40 %) est présent dans SG dans les cellules exprimant  PP et ceux de contrôle exprimant la GFP (figure 3.18.B). Les résultats décrits ci-dessus nous indiquent également que le mutant PP pourrait être un marqueur intéressant pour mesurer la formation des GS et de les visualiser sans qu’il y est formation de granules-dFMRP, que ce soit dans les cellules fixées ou les cellules vivantes. Cette caractéristique est importante afin de distinguer entre les granules-dFMRP induites par la surexpression dFMRP et les GS induites par un stress, et cela du fait qu’il n’est y a jusqu'ici aucun autre marqueur qui pourra nous aider à différencier entre ces deux types de granules à ARN.

58 Figure 3.17 le domaine PPID de la protéine dFMRP n’est pas important pour la localisation de la protéine dans les GS. Les cellules de drosophile ont été transfectées avec GFP-dFMRP et les 3 mutants GFP-KH, GFP-RGG et GFP-PP puis traitées avec arsenite 0.5mM pendant une 1 h puis fixées pour le protocole d’immunofluorescence. (A) Image d’immunofluorescence avec l’anticorps anti-dFMRP en rouge. (B) Immunofluorescence avec comme anticorps anti-deIF4E et anti-dPABP en rouge.

59 Figure 3.18 Les granules formés après traitement à l’arsénite sont des granules à ARN. Les cellules de drosophile ont été transfectées avec GFP-dFMRP et les 3 mutants GFP-KH, GFP-RGG et GFP-PP puis traitées avec arsénite 0.5Mm pendant une 1 h puis fixées pour le protocole d’hybridation in situ. (A) Détection des ARNm-polyA+ par la sonde oligo (dT) en rouge, Dapi en bleu. (B) Quantification relative des ARNm- polyA+ en pourcentage dans les granules formées suite au traitement par arsénites.

60 Pour vérifier si GFP-dFMRP est recruté dans SG, nous avons suivi les changements dans la distribution de la protéine dans les cellules vivantes de drosophile lors du traitement à l'arsénite.

Tout d'abord, nous avons suivi le mouvement du mutant PP qui devrait s'accumuler dans les GS lors du traitement d'arsénite. Nous avons constaté que l'arsénite induit la localisation du mutant PP dans les GS dès 15 minutes après le traitement et atteint son pic à 90 minutes (figure 3.19). Cette formation de SG s'est produite dans toutes les cellules exprimant le mutant PP validant ainsi les résultats obtenus dans des cellules fixées. Nous avons suivi le recrutement de GFP-dFMRP dans les GS. On sait déjà que l'expression de GFP-dFMRP peut induire les granules dFMRP, pour cela notre choix était basé sur la sélection de deux variétés de cellules avant de procéder au traitement arsénite et suivre le dynamisme de GFP-dFMRP : Les cellules avec les granules dFMRP préformées et les dépourvu de granules dFMRP.

Ceci est important afin d'évaluer si les granules dFMRP préformés peuvent affecter le recrutement de la GFP-dFMRP dans les GS. Nos résultats montrent que pour les cellules dépourvues des granules préformées dFMRP rapidement (≤15 min) après traitement arsénite, GFP-dFMRP est recruté dans les GS (figure 3.19). Nous avons également remarqué que la distribution de GFP-dFMRP dans des cellules contenant des granules préformés dFMRP n'a pas significativement changé lors d'un traitement arsénite (figure 3.19).

Nos résultats suggèrent que, bien que GFP-dFMRP qui se trouve dans le cytoplasme peut être recruté dans les GS induites par l'arsénite, GFP-dFMRP présente dans les granules- dFMRP ne peut pas être recrutée dans les GS. Cependant, on ne peut exclure la possibilité que la formation des GS puisse être modifié en raison de la séquestration des facteurs essentiels pour les GS dans les granules-dFMRP préformées. La répartition des mutants ΔKH et ΔRGG dans des cellules de drosophile contenant des granules-dFMRP préformées n'a pas subi de modifications lors du traitement d'arsénite, suggérant ainsi que dFMRP ne peut pas être transférée à partir de granules-dFMRP aux GS. Cependant, et

61 contrairement à GFP-dFMRP, nous ne pouvions pas observer un net changement dans la distribution de mutant soit, par exemple, dans leur recrutement au SG dans des cellules dépourvues de granules préformés dFMRP. Ces résultats suggèrent qu’à la fois le domaine KH et la boîte RGG de dFMRP sont nécessaires pour le recrutement de la protéine aux GS dans notre modèle de cellules drosophile. Dans ces conditions, le domaine PP de la protéine dFMRP n'est pas important pour le recrutement de dFMRP dans les GS.

Figure 3.19 Suivi du recrutement de GFP-dFMRP dans les GS. Images prises avant et après traitement arsénite (0.5mM) des cellules S2 transfectées avec GFP-dFMRP et les 3 mutants GFP-KH, GFP-RGG et GFP-PP

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