Caractérisation des phospholipides

1.3.1. Analyse qualitative et quantitative des acides gras des phospholipides par chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Cette analyse a été réalisée afin de caractériser plus précisément le type d’acide gras estérifié sur quelques uns des phospholipides du commerce utilisés pour la préparation de nos émulsions. Les acides gras ont été rendus volatiles par méthylation en présence de trifluorure de bore (BF₃-méthanol) (Ohta et al., 1990) et le bon déroulement de la méthylation a été vérifié en chromatographie sur couche mince (feuilles d’aluminium 5x7,5 cm recouvertes de gel de silice Kieselgel, Merck) par migration dans un mélange d’hexane/éther/acide acétique 80:20:1 (v/v/v), puis révélation par immersion dans une solution éthanolique d’acide phosphomolybdique à 10 %, puis chauffage quelques minutes à 150°C pour carboniser les spots. Les esters méthyliques ont été extraits par ajout de 2 mL d’hexane et 2 mL d’eau distillée, suivi d’une centrifugation 5 minutes à 2000 rotations par minute (rpm), et du prélèvement de la phase hexane supérieure. Après évaporation du solvant sous flux d’azote, les esters méthyliques ont été resolubilisés dans de l’hexane à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/mL pour procéder à l’analyse par CPG. Cette technique de chromatographie de partage met en jeu une phase mobile gazeuse et une phase stationnaire contenue dans une

colonne. Les échantillons vaporisés sont transportés par le gaz vecteur le long de la colonne, sur laquelle ils sont retenus par des interactions hydrophobes, puis de laquelle ils sont élués en fonction de leur masse et de leur polarité. L’appareil utilisé au laboratoire est un modèle Autosystem XL de Perkin Elmer, équipé d’une colonne capillaire de 30 m de long pour un diamètre extérieur de 0,25 mm recouverte d’une couche de polyéthylène glycol de 0,25 µm d’épaisseur. Le gaz vecteur est de l’hydrogène à la pression de 0,6 bar. Les différents esters méthyliques ont été élués suivant un programme de température (température initiale de 160°C augmentant d’1°C par minute jusqu’à 200°C) et détectés par ionisation de flamme (les molécules éluées sont brûlées en cations hydrocarbonés, qui génèrent un signal électrique converti en pic sur le chromatogramme de résultats). Du point de vue qualitatif, chaque composé possède un temps de rétention spécifique, et du point de vue quantitatif, la proportion du composé par rapport aux acides gras totaux est définie par l’aire de son pic (intégrée et normalisée).

1.3.2. Analyse de la compressibilité de certains lipides par la technique des films monomoléculaires

1.3.2.1. Principe de la technique

La technique des films monomoléculaires, encore appelée technique des monocouches, découle des travaux du physicien américain Langmuir et de son assistante Miss Blodgett, qui mirent en évidence le fait qu’une goutte d’huile (molécule amphiphile) déposée sur une surface statique d’eau s’étale jusqu’à former un film monomoléculaire. La préparation d’une monocouche consiste donc à étaler des molécules lipidiques dissoutes dans un solvant organique volatile sur une solution tampon (appelée subphase), afin d’obtenir, après évaporation du solvant, des molécules libres à l’interface eau/air. Leur compressibilité peut alors être étudiée à l’aide d’une balance de Langmuir. Celle-ci est constituée d’une cuve et de deux barrières mobiles entièrement recouvertes de téflon, seul matériau capable d’assurer l’uniformité du film. La force exercée par la monocouche sur les barrières qui limitent son étalement est transmise à un galvanomètre par l’intermédiaire d’une lamelle, mobile dans le plan vertical, plongée dans la monocouche. Le galvanomètre envoie alors un courant qui permet de compenser exactement la force exercée par la monocouche, et la valeur du courant donne la valeur de la pression de surface de la monocouche. En resserrant lentement les barrières mobiles de la balance, on compacte les molécules lipidiques les unes sur les autres, ce qui entraîne une augmentation de la pression de surface et force les molécules à s’orienter dans l’axe vertical afin qu’elles minimisent l’aire occupée individuellement. En représentant

l’évolution de la pression de surface en fonction de l’aire accessible à chaque molécule amphiphile (appelée aire moléculaire) durant la compression de la monocouche, on obtient une isotherme de compression.

1.3.2.2. Déroulement de la mesure

La balance de Langmuir a été placée dans une enceinte thermostatée à 37°C. Entre chaque mesure, la cuve, les barrières et la lamelle du galvanomètre ont été soigneusement nettoyées par rinçages successifs à l’eau distillée, à l’éthanol, puis à nouveau à l’eau distillée (le téflon, très fragile, ne doit pas être rayé). L’utilisation de la technique des monocouches ayant pour objectif d’élucider les mécanismes par lesquels les phospholipides modulent la lipolyse gastrique, la subphase utilisée était du tampon de lipolyse gastrique (acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 150 mM, chlorure de calcium 6 mM, pH 5,40). Ce tampon a été chauffé à 37°C, puis filtré (filtre Express™PLUS 0,22 µm, Millipore). Après avoir nettoyé la surface de la subphase au moyen d’une des barrières, 10 à 30 µg des lipides choisis (solutions à 10 mg/mL dans du chloroforme/méthanol 2:1) ont été déposés très délicatement avec une seringue Hamilton (rincée trois fois dans l’éthanol, trois fois dans l’eau distillée et trois fois dans le chloroforme/méthanol 2:1 avant chaque dépôt). La quantité de lipide déposée devait être suffisamment grande pour atteindre l’affaissement du film lipidique avant que les barrières mobiles n’aient terminé leur course, mais suffisamment petite pour que les molécules ne soient pas d’emblée compactées. Le dépôt adéquat correspondait à une pression de surface initiale comprise entre 0,2 et 1,5 mN/m selon la molécule lipidique. La compression (à la vitesse de 10 mm par minute) était lancée après stabilisation de cette pression de surface initiale. Le logiciel associé à notre balance de Langmuir indiquait l’évolution de la pression de surface en fonction de l’aire totale occupée par la monocouche.

Les isothermes de compression ont été obtenues en calculant l’aire moléculaire avec la formule suivante :

Aire totale occupée par la monocouche (Ų) Aire moléculaire (Ų/molécule) =

Nombre de molécules déposées

où

Masse de lipide déposée (g) Nombre de molécules déposées = Nombre d’Avogadro ×

Masse moléculaire du lipide (g/mol)

A partir de ces isothermes de compression, la compressibilité des différents lipides testés a été déterminée en représentant l’évolution de l’inverse de la pente de l’isotherme de compression en fonction de la pression.