Caractérisation des communautés microbiennes totales et actives

Bien que les méthodes culturales permettent d’isoler et de caractériser les microorganismes endogènes d’un sol, seulement 1% d’entre eux sont cultivables ce qui limite leur étude. L’utilisation d’approches de biologie moléculaire, à partir de l’ADN génomique extrait du sol, permet d’obtenir une vision plus exhaustive de la communauté microbienne d’un environnement. L’utilisation de différentes techniques décrites ci-dessous a permis de caractériser la variabilité spatiale et temporelle dans la rhizosphère des communautés microbiennes, en termes d’abondance (PCR quantitative en temps réel) mais aussi de diversité et de structure (Pyroséquençage-454, Roche). Par ailleurs, la variabilité des communautés fonctionnelles, potentiellement impliquées dans la biodégradation des HAP, a été étudiée en ciblant des gènes de fonctions (HAP-dioxygénase). Enfin, la diversité des communautés

actives a été déterminée en parallèle, via des extractions de l’ARN total du sol, convertit en

2.3.3.1 Extraction d’ADN génomique

L’ADN génomique total a été extrait à partir de 0,5 g de terre (humide, stockée à -80°C) en utilisant le kit FastDNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, France), selon le protocole fourni. Brièvement après une étape de lyse cellulaire mécanique et de précipitation des protéines, l’ADNg a été fixé sur une matrice de silice, purifié sur colonne par 500 μl d’une solution de lavage puis élué dans 100 μl d’eau Dnase-free. La concentration et l’absorbance des extraits à 260 et 280 nm ont été mesurées à partir de 3 μl, au spectrophotomètre (UV1800, Shimadzu), à l’aide d’un module Tray cell (Hellma). La pureté des acides nucléiques a été

estimée en calculant le ratio A260/A280 (révélateur de la contamination en protéines) qui doit

être compris entre 1,8 et 2 pour être acceptable. Les extraits ont été dilués au 1/10ème afin de

réaliser les amplifications par PCR. Les échantillons d’ADNg, préparés au cours des

expérimentations en rhizotron N°2, ont été quantifiés après une dilution au 1/40ème en utilisant

le kit Quant-iT PicoGreen asDNA Assay kit (Invitrogen) grâce à une gamme étalon allant de 0,03125 à 2 ng d’ADN/μl, à 480 nm au lecteur de microplaques Xenius (SAFAS, Monaco). Ces extraits ont ensuite été dilués à 2 ng/μl avant amplifications.

2.3.3.2 Extraction d’ARN

Au cours de l’expérimentation en rhizotron N°2, des extractions d’ARN totaux ont été réalisées à partir du même aliquot de 0,5 g de sol (humide, stocké à -80°C) utilisé pour extraire les ADNg. Après avoir fixé l’ADNg à la matrice de silice, les ARN totaux ont été précipités par 100 μl d’acétate de sodium (0,1Volume, 3M, pH 5,2) et 1 ml d’isopropanol (1 nuit à 4°C) à partir des lixiviats obtenus. Après avoir resuspendu les extraits dans 45 μl d’eau Rnase-free (MP Biomedicals, France), deux traitements DNase successifs ont été réalisés avec entre chacun une étape de purification des ARN en utilisant le kit RNeasy MinElute

Cleanup kit (Qiagen) selon le protocole fourni. Brièvement, 10 μl de tampon DNase Mg2+

(10x) et 1 μl d’enzyme DNase (1 unité/μl) ont été ajoutés à chaque extrait. Le mélange réactionnel a été incubé 1 heure à 37°C, puis l’utilisation de colonne et d’étape de nettoyage ont permis d’éluer 30 μl d’extrait pure. Puis les extraits ont été quantifiés après une dilution

au 1/40ème, en utilisant le kit Quant-iT RicoGreen RNA Assay kit (Invitrogen), grâce à une

gamme étalon allant de 0,03125 à 2 ng d’ARN /μl à 480 nm au lecteur de microplaques Xenius (SAFAS, Monaco), afin de convertir en ADN complémentaire (ADNc) une quantité d’ARN identique pour chaque échantillon, correspondant à 22,272 ng d’ARN. Le mélange réactionnel de 20 μl, permettant la reverse transcription (SuperScript III First-Strand,

22,272 ng d’ARN pure, qui ont été placés 5 min à 65°C et 1 min sur glace. Puis 10 μl de tampon de réaction (2x) et 2 μl de mix enzyme ont été ajoutés au mélange et placés 10 min à 25°C, 50 min à 50°C et 5 min à 85°C.

2.3.3.3 PCR quantitative en temps réel

L’abondance des communautés fongiques, bactériennes et celle des bactéries dégradant les HAP, a été mesurée par PCR quantitative en temps réel selon les conditions détaillées dans le

Tableau 2.4 et décrites par Cébron et al. (2008); Thion et al. (2013). Le mélange réactionnel

de 20 μl, contenait 10 μl de mix iQ SYBR green SuperMix (Bio-Rad), 0,8 μl de chaque amorce (10 μM), 0,4 μl de BSA 3% (sérum albumine bovine), 0,2 μl de DMSO (diméthylsulfoxyde), 0,08 μl de protéine gp32 du bactériophage T4 (MP Biomédicals, France) et 1 μl d’ADNg dilué ou d’ADNc pur. L’amplification et la quantification ont été réalisées en utilisant le thermocycler CFX96 (Bio-Rad) associé à un logiciel de traitement (Bio-Rad CFX

Manager, version 2.0) et une gamme de dilution de standard allant de 108 à 101 copies de

gènes par μl. Un facteur de correction, prenant en compte l’humidité de la terre, a été appliqué afin d’exprimer les résultats en nombre de copie de gène par gramme de terre sèche. L’abondance des communautés fongiques et des communautés bactériennes dégradant les HAP a été exprimée en pourcentage par rapport à l’abondance de la communauté bactérienne totale.

Tableau 2.4. Caractéristiques des programmes et des amorces utilisées dans le cadre des PCR quantitatives en temps réel.

2.3.3.4 Séquençage haut débit : étude de la diversité

2.3.3.4.1 PCR

Les régions V4-V5 de l’ADNr 16S (392 pb) bactérien et ITS1 fongique (400 pb) ont été

amplifiées par PCR à partir de l’ADNg selon les conditions décrites dans le Tableau 2.5, afin

d’étudier respectivement la diversité bactérienne et fongique

Tableau 2.5. Caractéristiques des programmes et des amorces utilisées dans le cadre des PCR pour le pyroséquençage 454 Roche.

Pour chaque échantillon les amplifications ont été réalisées en cinq réplicats indépendants, avec un couple d’amorces présentant à son extrémité 5’ une séquence de 10 nucléotides spécifique de chaque échantillon, appelée MID (Multiplex Identifier, Roche), permettant d’identifier son appartenance à un échantillon. Le mélange réactionnel de 50 μl contenait 10 μl de mix PCR prêt à l’emploi Taq-&Go™ (MP Biomedicals), 1 μl de chaque amorce (10

RNase-free (MP Biomedicals, France). L’efficacité et la spécificité des PCR ont été vérifiées par migration (100 mV) par électrophorèse sur gel d’agarose 1% dans du TAE 1x (Euromedex), et observées après coloration au bromure d’éthydium sous UV au GelDoc XR (Bio-Rad). Les 5 produits PCR ont été poolés, purifiés avec le kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) puis quantifiés au spectrophotomètre (UV1800, Shimadzu) à l’aide d’un module Tray-cell (Hellma) afin de préparer des mélanges équimolaires de 50 μl à 40 ng d’ADN/μl

d’amplicons 16S ou ITS, regroupant la série d’échantillons à analyser (Figure 2.4).

Figure 2.4. Préparation des échantillons en vue de la réalisation du pyroséquençage 454/Roche GS-FLX Titanium.

2.3.3.4.2 Pyroséquençage 454

Le pyroséquençage a été réalisé par Beckman Coulter Genomics (Danvers, USA) en utilisant

la technologie 454/Roche GS-FLX Titanium décrite dans la Figure 2.5. Tout d’abord, 2

librairies d’ADN simple brin ont été construites à partir des mélanges équimolaires d’amplicons 16S et ITS, en liant deux adaptateurs (A et B) à chacune des deux extrémités des fragments. Puis une PCR en émulsion a été réalisée après avoir fixé chaque simple brin

d’ADN sur une bille indépendante (A) via les adaptateurs, permettant d’amplifier un unique

fragment par bille. Le pyroséquençage, réalisé après avoir réparti chaque bille dans un puits d’une plaque PTP (Pico Titer Plate), consiste en la succession de 3 réactions enzymatiques, permettant la capture d’un signal lumineux après incorporation de chaque nucléotide, ajouté de manière séquentielle, complémentaire du simple brin fixé à la bille, et permettant l’obtention d’un pyrogramme correspondant à la séquence nucléotidique.

16

S

IT

S

Extraction d’ADNg

(FastDNA SPIN Kit for soil ) PCR 16S (V4-V5) (5 réplicats) ^{PCR ITS (ITS1) (5 réplicats) Mélanges équimolaires} des amplicons purifiés

1

2

3

Figure 2.5. Technologie du pyroséquençage 454 Roche (d’après http://454.com/index.asp).