Caractérisation des bactéries lactiques isolées à partir du blé fermenté par MALDI-TOF MS

Une quinzaine d’isolats bactériens ont été soumis à une analyse de cellule entière de type MALDI-TOF MS. Cette méthode discrimine les bactéries sur la base du criblage des pics observés en tant que biomarqueurs protéiques pour l’identification des bactéries (Hollande et al., 1996). Cette stratégie est améliorée par l’utilisation d’une ou plusieurs souches de références pour chacune des espèces qui doivent être incluses dans la base de données (Williams et al., 2003 ; Chen et al., 2008).

Dans notre cas, le traitement des données a été réalisé par le logiciel MALDI BioTyper TM4.0 (MALDI Biotyper4.0 Data base BruckerDaltonics, Germany).

L’identification des spectres des isolats bactériens a été réalisée à l’aide d’un algorithme de reconnaissance qui considère les positions des pics dont l’intensité correspond à une échelle de 1 à 1000 (Bright et al., 2002 ;Freiwald et al., 2009). Le logiciel génère automatiquement les listes de pics à partir de tous les spectres et extrait les pics typiques qui sont présents dans les spectres répertoriés pour une espèce donnée.

Les figures24 à 30 illustrent les spectres de masse recueillis des 4 isolats bactériens réalises par le logiciel MALDI-TOF MS BiotyperBrucker.

Tableau 13: Identification des isolats bactériens par MALDI-TOF MS.

Isolats Identification Score NCBI à identifier

BHL 27 Lactobacillus plantarum 2.023 1590

BHL 23 Lactobacillus plantarum 2.064 1590

BHL8 Lactobacillus brevis 2.201 1580

BHC6 Pediococcusacidilactici 1.77 1254

Un matching score ou score d’appariement et de fiabilité d’identification, basé sur les masses identifiées et la corrélation de leurs intensités est généré et utilisé pour classer les résultats.

86 Un score supérieur à 2.000 ou compris entre 2.000 et 3.000 indique une bonne fiabilité et une forte probabilité de l’identification de l’espèce. Le rang du genre, à ce score étant totalement sécurisé (Gidenn, 2001 ; Blondiaux, 2013).

Tableau 14: Score de concordance des spectres obtenus à partir d’une bactérie d’intérêt avec ceux de la base de données Biotyper, reflétant le degré de confiance à accorder à l’identification.

Score Description Symbole

2,300 – 3,000 Forte probabilité d’identification à l’espèce +++

2,000 – 2,299 Identification du genre sécurisée, identification à l’espèce probable

++

1,700 – 1,999 Identification au genre probable +

0,000 – 1,699 Degré de confiance insuffisant pour l’identification -

Selon les données présentées dans le tableau 15 et les figures 17 à 33, nous déduisons que :

 3 isolats ont été identifiés au rang de genre sécurisé (score >2.000) et l’espèce probable  1 isolat a été identifié au rang de genre probable (score > 1.700).

Les isolats soumis à l’analyse protéomique sont identifiés comme suit :

BHL27 : Lactobacillus plantarum DSM 20246 DSM BHL23 : Lactobacillus plantarum DSM 20246 DSM BHL 8 : Lactobacillus brevis DSM 1268 DSM BHC 6 : Pediococcusacidilactici146 RLT

En comparant les résultats de l’identification phénotypique avec ceux obtenus par MALDI- TOF MS, on constate que seule l’espèce Pediococcus acidilactici (BHC6) a été identifiée par les deux méthodes. En ce qui concerne Lactobacillus (BHL23, BHL27) identifiés par la méthode phénotypique comme Lactobacillus casei, les résultats protéomique ont montré que ces isolats sont Lactobacillus plantarum.

La caractérisation protéomique a permis l’identification de 4 bactéries lactiques avec de bons scores.

L’analyse protéomique a montré que les bactéries lactiques les plus fréquemment détectées sont les lactobacilles essentiellement représentés par l’espèce Lactobacillus plantarum. En effet,

87 cette dernière a été isolée à partir de nombreux substrats à base de céréales (blé, mil, sorgho, maïs et seigle).Il est connu comme groupe majoritaire de la microflore lactique des produits traditionnels (pâte ou purée et bouillies non alcoolisées) obtenus à partir du mil, sorgho et maïs en Afrique de l’Ouest (Yao et al 2009 ; Louembé et al., 2003). Lactobacillus plantarum est l'espèce qui a été isolée des levains de seigle russe et finlandais en tant que microorganisme prédominant (Rosenquist et Hansen, 2000).Il a également été détecté à partir du levain traditionnel de blé iranien (Golshanet al., 2014) et albanais (Nionelliet al., 2014).C’est un groupe qui fait partie des bactéries commensales dont l’utilisation est courante comme probiotique chez les êtres humains et animaux (Ouwehand et al., 2002).

88

Figure 25 : Spectre de Lactobacillus plantarum BHL23

89

Figure27 : Spectre de Lactobacillus brevis BHL8

90

Figure 29 : Spectre à pic Lactobacillus plantarum BHL23

91

Figure 31 : Spectre à pic Lactobacillus brevis BHL8

92 L’espèce Lactobacillus plantarum est décrite comme très active dans la fermentation panaire (Lonner et Preve-Akesson, 1988).Des auteurs ont rapporté que parmi les bactéries lactiques isolées des farines, les espèces Lactobacillus plantarum et Pediococcus pentosaceus sont les plus fréquentes et représentent plus de 85% des isolats homofermentaires(DeVuyst et Neyssens, 2005 ; DeVuyst et Vancanneyt, 2007 ; Corsetti et Settani, 2007).L’espèce Lactobacillus plantarumest une espèce communément isolée à des fréquences variables de différents produits fermentés, des levains, des produits laitiers et des produits végétaux (Tanasupawat et al., 1992 ; Tanasupawat et al., 2002).Gobbetti et al.( 1995) et Corsetti et al. (2001) ont rapporté que l’espèce Lactobacillus plantarum a été isolée des farines italiennes avec une faible fréquence. Contrairement aux travaux effectués par Ricciardi et al. (2005) sur le levain utilisé dans la préparation du pain traditionnel du blé dur italien, le microorganisme le plus dominant est Lactobacillus plantarum avec une fréquence de 49%. Quant à l’espèce Lactobacillus brevis, elle est présente dans les produits amylacés non alcoolisés.

Lactobacillus plantarum et Lactobacillus brevis sont deux espèces qui sont présentes dans la fermentation d’un grand nombre de variété de produits alimentaires carnés (Rhee et al., 2011 ; Kröckel et al., 2013) et également dans les fruits, légumes et plantes ( Karavoicova et Kohajdova, 2003 ;Rhee et al., 2011 ; Swain et al.,2014). Ces deux espèces sont aussi connues en tant qu’agents altérants dans le jus et la bière (Arena et Manca de Nadra, 2001 ; Fguiri et al., 2012).

L’espèce Pediococcus acidilactici est une espèce majoritaire présente dans les farines de blé marocaines (Ennadir et al., 2014) rejoignant les travaux de Hardy (1982), Bervas (1991) et Infantes et Tourneur (1991) lors de leurs investigations sur la microflore lactique des farines de blé français. Dans le blé fermenté, cette espèce a été détectée seulement dans 4 échantillons. Louembé et al. (2003) ont signalé qu’en général, les pediocoques sont fréquemment isolés de plusieurs produits végétaux. En outre, le genre Pediococcus a été détecté dans les produits végétaux (céréales, choucroute, olives, concombre) et les produits fermentés (bière) (Louembé et al., 2003).