Calibration et quantification

Les courbes de calibration ont été établies dans le sang dilué dans un milieu basique, à des concentrations comprises entre 0-30 µg L-1_.

Trois étapes de rinçage ont été effectuées afin de limiter la contamination croisée entre deux échantillons biologiques consécutifs : (1) eau ultra pure, (2) 1% NH4OH, (3) encore de l’eau

pendant 1 minute chacune.

L’analyse de blanc de matrice nous a permis de vérifier l’absence de contamination, pouvant être aussi bien due à des effets mémoire, à la présence d’interférences spectrales qu’à l’utilisation de la sonde en titane.

Résultats et discussion

Afin d’évaluer les risques sanitaires de la façon la plus représentative possible, il est indispensable que les conditions in vivo soient le plus fidèlement reproduites lors d’études nanotoxicologiques. Pour cela, la caractérisation des nanoparticules doit dans un premier temps, être réalisée dans des conditions physiologiques représentatives malgré la complexité du milieu. Cette étape est indispensable afin d’obtenir une meilleure compréhension du comportement des NPs [235]. Le sang est une matrice complexe dont la composition typique est présentée dans le Tableau 8. (Section 2.1.2, Chapitre 2). Taurozzi et al. [92], ont récemment démontré les enjeux liés à la préparation d’une suspension stable de SRM 1898 dans les milieux biologiques. Des paramètres tels que l’ordre d’ajout, le choix du dispersant et la concentration en nanoparticules doivent être optimisés pour obtenir une quantification juste et précise. Ainsi les sections suivantes abordent les différentes stratégies étudiées afin de proposer une procédure de mise en suspension robuste adaptée à la matrice sanguine.

Ordre d’ajout des nanoparticules

Par ordre d’ajout, il s’agit ici de définir la meilleure procédure afin de mettre en contact les NPs TiO2 et le milieu d’étude. Les ordres possibles sont les suivants : (1) ajout des NPs dans le sang

puis dilution de la matrice ou (2) ajout du sang dans la suspension de NPs diluée [92].

Pour l’urine (section 4.5.1, Chapitre 4), il avait été montré qu’un aliquot d’urine est d’abord prélevé, dilué puis fortifié avec la solution stock SRM 1898, représentant le deuxième scénario énoncé.

Les deux procédures d’ajout ont été testées dans le sang. Les résultats de l’analyse sont exprimés sous forme de taille la plus fréquente (MFS) et distribution en taille.

Figure 64 : Distribution en taille des NPs TiO2 selon les deux ordres de fortification : 1) ajout de

la suspension SRM 1898 dans le sang et 2) ajout du sang dans la suspension SRM 1898.

Dans la Figure 64, l’ajout de sang à la suspension (ordre 2) entraîne une distribution en taille plus large et une valeur de MFS plus importante (36-290 nm; 102 nm). À l’inverse, l’ajout de la suspension directement dans la matrice sanguine (ordre 1), conduit à une MFS de 92 nm, pour une distribution comprise entre 36-210 nm. Par ailleurs, les fréquences maximales sont de 147 et 42, pour les ordres 1 et 2, respectivement. Ainsi, pour l’ordre 2, une fréquence plus faible combinée à une augmentation de la MFS témoigne d’un certain degré d’agglomération. L’ordre 1, quant à lui, semble favoriser la stabilité des NPs TiO2 lors de leur mise en contact avec le milieu d’étude.

Dans leurs travaux, Taurozzi et al. [92], ont démontré que l’excès de protéines présentes dans le sang induit leur adsorption à la surface des NPs, formant dès lors une couronne protéique. Celle- ci va générer une répulsion stérique et limiter ainsi les interactions de VDW (section 2.1.2.2, Chapitre 2), ce qui permet de les maintenir plus facilement dans un état colloïdal.

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 0 20 40 60 80 100 120 140

Fr

eq

ue

ncy (

cou

nts)

MFS (nm)

Ordre 1

Ordre 2

En conclusion, la mise en contact des NPs TiO2 avec la matrice reposera sur l’ordre 1 : ajout de la

solution stock SRM 1898 dans le sang, puis dilution dans un milieu approprié.

Il est à noter que, ces auteurs mentionnent également le besoin d’une stabilisation des NPs TiO2

antérieure à la mise en contact avec le milieu, via l’addition de protéines. Cependant, la présence de PVP-10 nous permet de nous affranchir de cette stabilisation supplémentaire.

Choix du diluant

Afin d’assurer la stabilité des NPs d’or et d’argent dans le sang, divers diluants tels que l’hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH) [217, 230, 232], l’ammoniaque (NH4OH 0,5%)

ou le Triton X-100 [197, 217, 230] ont été reportés dans la littérature. En effet, une dilution en milieu basique avec NH4OH à 0,5% favorise l’hémolyse et la dissolution des protéines, permettant

la limitation de la formation d’interférences polyatomiques [237]. Le triton X-100 est quant à lui, un tensioactif permettant de maximiser la nébulisation et limiter l’adhésion de l’échantillon aux parois du nébuliseur. Le TMAH est couramment utilisé dans les milieux biologiques pour l’analyse de NPs d’or et d’argent [234]. Ce dernier est une base forte permettant l’extraction des NPs via une digestion des tissus [238] et la solubilisation des protéines [221, 236].

Concernant les NPs TiO2, dans leurs travaux, Krystek et al. [185], utilisent de l’éthanol afin de

diluer les tissus biologiques. L’ajout d’alcool, tel que l’éthanol, permet quant à lui l’amélioration de l’ionisation au sein du plasma de l’ICP.

Puisque l’utilisation de PVP-10 pour la stabilisation des NPs a démontré une efficacité supérieure vis-à-vis du Triton X-100 [128], ce dernier n’a pas été étudié. Par ailleurs, souhaitant tirer avantage de la contribution des protéines en lien avec la répulsion stérique sans les solubiliser, l’utilisation de TMHA n’a également pas été étudiée.

Les effets quant à la stabilité de la dispersion des NPs TiO2 dans le sang ont été étudiés en présence

de NH4OH 0,5%, EtOH 1% ainsi qu’une combinaison des deux diluants. Ces milieux sont

couramment utilisés au sein du CTQ pour la dilution des échantillons sanguins lors des analyses de routine toxicologiques. Les résultats sont présentés sous forme d’histogramme de taille la plus fréquente (MFS) et de pourcentage de récupération.

Figure 65 : Effet du milieu de dilution sur la MFS et le pourcentage de récupération en concentration massique des NPs TiO2. Les incertitudes présentées constituent les écarts-types pour

3 réplicas

Dans la Figure 65, les MFS mesurées pour les trois diluants sont comprises entre 83-94 nm. L’absence de déviation pour la MFS dans les deux premiers milieux témoigne d’une forte répétabilité. La taille la plus petite est obtenue en présence de NH4OH, indiquant un faible état

d’agglomération. Cependant, le pourcentage de récupération mesuré est uniquement de 55 ± 3 %. Lorsque l’éthanol à 1% est utilisé comme diluant, la valeur de la MFS est de 94 nm, soit comprise à l’intérieur de l’intervalle de valeurs fourni sur le certificat d’analyse du standard NIST 1898 (71- 112 nm) [74]. De plus, le pourcentage de récupération est nettement supérieur à celui obtenu avec NH4OH, s’élevant à 81 ± 4 %. Le mélange des deux milieux conduit à une MFS proche de celle

obtenue dans l’éthanol uniquement, mais une diminution de la récupération est observée (75 ± 2 %). Ainsi, ce milieu n’offre pas d’amélioration considérable concernant la préparation d’échantillon. 83 94 93 55 81 75

NH4OH 0,5% EtOH 1% EtOH 1% + NH4OH 0,5%

0 20 40 60 80 100 120 140 MFS Récupération

MF

S (nm

)

Récup

ér

atio

n (

%)

Les valeurs du bruit de fond sont comparables pour l’ensemble des trois milieux. Ainsi la dissolution partielle des NPs TiO2 en titane dissout, permettant de justifier la faible récupération

en présence de NH4OH, est écartée. La Figure 66 présente les distributions en taille obtenues dans

l’ammoniaque et l’éthanol, respectivement. La largeur des distributions est similaire, soit comprise entre 28-220 nm, avec une fréquence plus élevée pour NH4OH. Ainsi, il n’y pas de discrimination

concernant l’ionisation de NPs de tailles plus importantes.

Figure 66 : Distribution en taille du SRM NIST 1898 dans un échantillon sanguin dilué avec a) de l'ammoniaque à 0,5% et b) de l'éthanol à 1%

La faible agglomération observée dans chacun des cas, se traduisant par des valeurs de MFS supérieures à 70 nm [128], trouve son origine dans deux phénomènes. Premièrement, le pH de la suspension de SRM NIST 1898, préparée dans ces conditions, est aux alentours de 4, assurant ainsi une bonne stabilité de la suspension (potentiel zêta 35 mV), comme présenté dans la Figure 67, tandis que celui du milieu d’étude est d’environ 7. Ainsi, le changement brutal de pH combiné à un rapprochement du pI, favorise la formation d’agglomérats.

100 200 300 0 50 100 150 200 250 300 Fr eq ue ncy MFS (nm) 100 200 300 0 50 100 150 200 250 300 350 Fr eq ue ncy MFS (nm) a) b)

Figure 67 : Évolution du potentiel zêta en fonction du pH pour une suspension de 10 mg de SRM 1898 dans 50 mL d'eau. [92]

Dans un second temps, considérant la richesse en espèces ioniques de la matrice sanguine, des effets d’écrantage des charges de surface des NPs TiO2 peuvent être présents [92]. Cela se traduit

dès lors par une diminution des forces de répulsion électrostatique et ainsi une déstabilisation. En conclusion, l’usage d’EtOH 1% offre une amélioration considérable en termes de pourcentage de récupération, comparé aux deux autres milieux. Par ailleurs, la MFS mesurée s’approche de celle attendue.

Facteur de dilution

Pour évaluer l’effet de la contribution des protéines sur la stabilité des nanoparticules, des échantillons de NIST 1898 ont été préparés dans le sang selon des facteurs de dilution 1:10 et 1:20 (sang : diluant). Dans la littérature, ce dernier représente le coefficient de dilution le plus utilisé pour l’analyse de NPs d’or et d’argent dans le sang [201, 234].

Des tests supplémentaires ont été réalisés afin d’évaluer l’effet de la concentration en NPs TiO2

sur les états d’agglomération. La matrice diluée 1:20 a été fortifiée avec une suspension de 10 mg mL-1, puis diluée à une concentration de travail de 5 ng mL-1 (dilution 1) et 1 ng mL-1 (dilution 2). L’ensemble des résultats sont présentés dans le tableau 22.

Tableau 22 : Effet de la dilution de la matrice et de la concentration des nanoparticules sur la mesure de la taille et du pourcentage de récupération (n=3)

Facteur de dilution MFS (nm) Récupération (%)

Ratio sanguin (n=3) 1:10 120 ± 0 25 ± 3 1:20 92 ± 0 81 ± 4 Concentration en nanoparticules (n=3) 5 ng mL-1 101 ± 0 40 ± 1 1 ng mL-1 _{92 ± 0 81 ± 4}

Basé sur les résultats présentés au tableau 22, un facteur de dilution de 1:10 se traduit par une MFS plus large et une récupération plus faible, indiquant un état d’agglomération plus important. Certains auteurs [92], ont attribué cette déstabilisation au changement de pH présenté dans la section précédente. Ces auteurs ont effectué des tests complémentaires pour démontrer leur hypothèse. Le pH de la matrice sanguine fut ajusté à 4, soit identique à celui de la suspension SRM 1898, avant de les mettre en contact. Les états d’agglomération furent dès lors éliminés. Cependant, il est important de noter l’impossibilité d’ajuster le pH des échantillons biologiques lors de leur analyse, l’acidification du milieu peut entraîner une déstructuration et une dénaturation irréversibles des protéines dans la matrice [92]. Par ailleurs, une acidification du sang entraîne une précipitation donc a fortiori une hétérogénéité de l’échantillon.

Ainsi une matrice moins concentrée telle que celle ayant une dilution 1 : 20 permet l’obtention d’une suspension plus stable. La MFS mesurée est de 92 nm, avec un pourcentage de récupération de 81 ± 4 %. Ce facteur de dilution semble adapté à l’analyse des NPs dans le sang.

Le tableau 22 montre également qu’une concentration plus importante en NPs TiO2 conduit à une

perte de stabilité dans le sang. Cette observation peut être expliquée en partie par le phénomène de coïncidence présenté dans la section 2.2.3.5.2 (chapitre 2), une concentration suffisamment faible en NPs permet leur détection individuelle et ainsi une meilleure quantification. Le facteur de dilution à 1 ng mL-1 permet également une diminution de la fréquence des collisions inter- particulaires, offrant aux protéines suffisamment de temps pour saturer la surface des NPs et ainsi

favoriser la gêne stérique [92]. Ainsi, une concentration de 1 ng mL-1 _{fut le choix final pour une}

analyse SP-ICP-MS dans le sang, résultant en une récupération de 81 % et une MFS dans la plage de taille attendue.

Conclusion

En vue de réaliser des études nanotoxicologiques, l’analyse dans le sang est d’un intérêt majeur, en tant que vecteur des NPs dans le corps humain. Afin de permettre une compréhension complète de l’interface nano-bio chez l’être humain, la caractérisation des NPs dans cette matrice complexe est indispensable [235].

L’enjeu principal d’une telle caractérisation réside dans la préparation d’échantillon. Dans ce chapitre, plusieurs conditions ont été testées afin de développer une procédure de mise en suspension optimale, permettant leur quantification. Cette stabilité fut démontrée par SP-ICP-MS via la détermination de la MFS et des pourcentages de récupération.

La procédure développée est minimale, mais chaque détail est d’une grande importance. La solution stock de SRM 1898 est préparée à une concentration de 10 mg mL-1 dans du PVP-10 2 %. Un aliquot de 10 µL est ajouté dans un échantillon de sang puis dilué à un facteur 1 :20 dans EtOH 1%. Cette méthode a démontré sa précision, avec une taille mesurée de 92 nm et un pourcentage de récupération 81 %. Comparativement avec l’urine, l’analyse dans le sang conduit à une mesure de MFS plus faible et une amélioration de la quantification en concentration massique (106 ± 3 nm et 73 % dans l’urine). Ainsi la présence des protéines semble contribuer à la stabilisation des NPs TiO2 SRM 1898 dans le sang.

Dans l’optique de travaux futurs, la méthode proposée ici devra être validée selon les recommandations de la norme ISO/CEI 17025:2017. Les travaux devront reposer sur la méthodologie présentée dans le chapitre 4 (« Quantification of titanium dioxide nanoparticules in human urine by Single-Particle ICP-MS »), constituant la première validation d’une méthode de quantification de NPs dans les fluides biologiques par SP-ICP-MS. Les paramètres à valider seront identiques : les limites de détection et de quantification en taille et en concentration massique, le domaine de linéarité (en concentration massique), la répétabilité et la reproductibilité, le

recouvrement et la robustesse. Comme il n’existe pas de matériaux de références, la méthode des échantillons enrichis avec le SRM NIST 1898 devra être utilisée.

En conclusion, l’addition de la suspension SRM 1898 (dans du PVP 2% aqueux) directement dans les échantillons sanguins, favorise leur ajout dans un milieu extrêmement riche en protéines. La faible concentration en NPs permet de limiter les collisions inter-particulaires mais favorise également l’adsorption progressive de protéines sur la surface des NPs lors de leur incorporation dans le milieu. Cela semble limiter ainsi les effets d’agglomération inhérents au changement de pH.

Conclusion

Cette thèse de doctorat a été mise en place afin de répondre aux besoins d’évaluation des NPs dans les milieux biologiques. Réalisée en collaboration entre le Centre de Toxicologie du Québec et l’Université Laval, elle s’inscrit dans une démarche globale d’évaluation des risques d’exposition. Ce projet présente ainsi de nouvelles stratégies pour la détection et la quantification de nanoparticules de dioxyde de titane dans les matrices biologiques.

Les travaux de cette thèse ont porté dans un premier temps sur la préparation d’échantillons. Celle- ci se devait d’être facilement applicable en analyse de routine (grande échelle) et compatible avec l’urine et le sang. Parmi les nombreuses stratégies analytiques testées, l’ajout de polymère combiné à l’usage d’une sonde à sonication, permet l’obtention d’une suspension de NPs TiO2 stable dans

le temps. Cette procédure a su prouver sa robustesse et sa versatilité lors de son application à divers standards de NPs TiO2. Enfin, la conservation de la stabilité lors de l’ajout de NPs TiO2 en

suspension dans l’urine et le sang démontre son efficacité.

Cette méthodologie nous a permis dans la seconde partie du projet, le développement de méthodes SP-ICP-MS pour la détection et quantification des NPs TiO2 dans l’urine et le sang.

La matrice urinaire est la plus facile à obtenir et constitue un prélèvement moins invasif pour l’humain. Considérée comme une des voies d’excrétion principales des NPs TiO2, elle joue un rôle

majeur dans l’étude de l’exposition humaine. Toutefois, elle pose certains défis analytiques pour l’analyse par ICP-MS, étant une matrice chargée et pouvant présenter des effets de matrice. La méthode SP-ICP-MS a été développée et validée en accord avec la norme ISO 17025. Reposant sur une simple dilution des échantillons en milieu acide, elle permet la détermination précise de la taille, distribution en taille, concentration en ions dissous et concentration massique nanoparticulaire. Des pourcentages de récupération moyens de 70% ont été obtenus. Il s’agit de la première méthode de quantification validée en SP-ICP-MS pour les NPs TiO2 dans des fluides

biologiques.

Le sang a fait l’objet d’une attention particulière dans ce projet de doctorat, étant donné qu’il s’agit du principal vecteur des NPs TiO2 dans le corps humain. Bien que certaines étapes de la

préparation d’échantillon se différencient de celle de l’urine, la procédure d’analyse reste similaire. En effet, les NPs TiO2 ont été ajoutées avant dilution dans la matrice dans un milieu basique, afin

de favoriser une stabilisation via la présence de protéines. Cette méthode a permis la détermination précise des paramètres physico-chimiques des NPs tels que la taille, distribution en taille et concentrations. Par ailleurs, l’obtention de forts pourcentages de récupération, supérieurs à ceux obtenus dans l’urine, démontre une meilleure stabilité des NPs. En raison des conditions sanitaires liées à l’épidémie de la COVID-19, la méthode n’a pu être validée, cependant la méthode d’analyse est actuellement considérée comme optimisée.

Ainsi, ce projet de doctorat permet une avancée majeure dans l’étude du devenir des NPs dans les milieux biologiques. La méthodologie développée pour la préparation d’échantillons constitue une étape décisive pour la quantification des NPs dans les matrices humaines. La SP-ICP-MS, combinant la sensibilité, la spécificité et la sélectivité de l’ICP-MS adapté au suivi individuel des NPs, a su démontrer son efficacité tout au long de ce projet. En effet, le développement de ces méthodes a permis de prouver la capacité de la SP-ICP-MS à détecter et quantifier les NPs TiO2,

à de faibles concentrations dans chacun des milieux biologiques testés dans un temps d’analyse extrêmement court et impliquant une préparation d’échantillon réduite. Leur application dans l’évaluation de l’exposition humaine pourrait représenter une avancée importante dans la compréhension globale de la nanotoxicité.

Perspectives

Cette thèse a donné naissance à une procédure de mise en suspension ainsi qu’à deux méthodes d’analyse SP-ICP-MS dans l’urine et le sang, respectivement. Bien que les bases soient solidement ancrées, de nombreuses perspectives de recherche sont encore à envisager, afin de faire de ce projet une référence incontestable dans le domaine de la nanotoxicité.

Concernant les travaux futurs, des analyses complémentaires sur l’urine seraient intéressantes afin d’avoir une meilleure compréhension de la variabilité des pourcentages obtenus selon les diverses urines analysées. Des caractérisations pourraient être effectuées au CTQ pour évaluer l’impact des paramètres pouvant influencer la stabilité des NPs TiO2 : le pH, la densité, le taux de créatinine ou

d’urée.

Une validation en accord avec la norme ISO 17025 est également nécessaire pour la méthode de quantification dans le sang. Celle-ci repose sur la détermination des paramètres étudiés dans le chapitre 4. Seule la procédure de préparation d’échantillon sera légèrement différente. Une fois cette méthode validée, le CTQ sera dans la capacité de proposer des programmes de comparaison interlaboratoires, et le cas échéant, d’être considéré comme laboratoire de référence dans la mesure de nanoparticules dans les milieux biologiques.

Dans la continuité de ce projet, il serait intéressant d’utiliser une des fonctionnalités récentes en SP-ICP-MS, qui est la possibilité de suivre deux isotopes de façon quasi-simultanée. En effet, dépendamment de l’origine des NPs TiO2, ces dernières sont enrichies d’autres éléments. Le ratio

entre eux permet d’établir une signature élémentaire.

Cependant, il est important de noter que la technique SP-ICP-MS est encore à ses balbutiements. Ainsi, l’utilisation de cette technologie présente certaines limitations encore inéluctables à l’heure actuelle.

Afin de profiter pleinement des fonctionnalités proposées par la SP-ICP-MS, il paraît indispensable de développer de nouveaux standards certifiés. Il semble établit que l’analyse d’oxyde métallique (TiO2, SiO2, ZnO ou encore CeO), souffre du manque d’étalons certifiés en

taille commercialement disponibles. Ainsi, un des atouts majeurs de la SP-ICP-MS, reposant sur