3.2 Détermination de la structure d’Ub KEKS
3.2.6 Calcul de la structure d’Ub KEKS
La table des NOEs, les contraintes de lien hydrogène et les angles φ , ψ, et χ1 ont été soumis au logiciel ARIA2.3 (Rieping et al., 2007) couplé à CNS1.21 (Brünger et al., 1998) pour le calcul de la structure tertiaire de UbKEKS. Le logiciel ARIA2.3 permet de
traiter les attributions ambiguës des NOEs et CNS1.21 est le logiciel de calcul de struc- ture par refondue simulée (ou simulated annealing). Des ambiguïtés dans les NOEs sur- viennent lorsqu’une corrélation dans un spectre NOESY peut provenir de plus d’une paire de1H-1H. L’intensité de la corrélation représente donc la somme des contributions des différentes paires de protons. ARIA2.3 utilise un processus itératif pour l’attribution auto- matique de ces NOEs ambiguës. La première itération (itération 0) utilise seulement les NOEs non-ambiguës pour le calcul d’un ensemble de structures. À partir de cet ensemble de structures préliminaires, ARIA2.3 utilise les distances entre les atomes afin d’attribuer la contribution des paires 1H-1H pour chaque corrélation ambiguës. Ces contributions peuvent donc être utilisées pour le prochain calcul. Après chaque calcul, les contributions sont évaluées de nouveau et s’il y a lieu, de nouvelles de contraintes de distance sont générées jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de changement significatif entre deux calculs (typi- quement neuf itérations). Le calcul de la structure est effectué par le logiciel CNS1.21 et ce dernier utilise le modèle de simulated annealing pour l’optimisation des contraintes et
l’obtention d’une structure tertiaire. En résumé, l’approche du refondu simulé consiste en une suite de simulations de dynamique moléculaire en utilisant un champ de force modifié avec les contraintes de distances1H-1H, les liens hydrogènes et les angles dièdres φ , ψ et χ1. À la manière d’une diminution de la température, la force de ces contraintes est gra- duellement augmentée afin de replier la protéine. Cette routine est répétée plusieurs fois et les structures générées sont analysées et comparées. D’une part, l’énergie potentielle (res- pect des contraintes stéréochimiques et contraintes déterminées en RMN) de toutes les structures est calculée et d’autre part la précision avec laquelle les structures convergent vers une solution unique est évaluée.
Après la dernière itération, les structures avec les meilleures énergies potentielles sont sélectionnées pour être optimisées dans un solvant. Cette optimisation vient raffiner le placement des résidus se trouvant à la surface de la protéine. L’ensemble de structures finales est analysé dans le logiciel CCPNMR pour valider l’attribution et traiter les vio- lations. Les violations proviennent d’une attribution erronée dans les spectres NOESY et est donc modifiée ou simplement retirée de la table de contraintes. Une fois les violations traitées, une prochaine ronde de calcul avec ARIA2.3 et CNS1.21 est effectuée pour vé- rifier si les changements apportés sont les bons. Les résultats sortant de cette ronde sont encore une fois analysés dans CCPNMR et ce procédé est répété jusqu’à l’obtention d’un ensemble de structures et de contraintes ne contenant aucune violation majeure.
3.3 Évaluation de la dynamique moléculaire de la chaîne principale d’UbKEKS
La majorité des expériences utilisées pour l’évaluation de la dynamique d’une pro- téine se font à partir du 1H-15N HSQC. La dynamique évaluée est donc celle du lien 1H
N-15NH de la chaîne principale et est possible grâce à l’étude de la relaxation de la magnétisation des spins15N. La relaxation représente les mécanismes par lesquels la ma- gnétisation revient à l’équilibre (Mxy → Mz, figure 3.1) après une impulsion électroma- gnétique. Deux mécanismes sont impliqués, le premier est la perte de la cohérence entre les spins entraînant la diminution du signal dans le plan XY et le deuxième est le retour de la magnétisation en Z vers l’état d’équilibre. Le temps de relaxation T1est la constante de temps associée au retour de la magnétisation en Z et requiert un transfert d’énergie du spin vers le milieu pour un retour à l’équilibre des populations. Le temps de relaxation T2 est quant à lui la constante de temps associée à la perte de cohérence de la phase des spins d’un système et est dû aux interactions entre les spins. Les temps de relaxation T1et T2 peuvent aussi être exprimés en taux de relaxation R1et R2respectivement, où R1=1/T1et R2=1/T2.
αα αβ βα ββ ωa ωa ωx ωx ωα+ωχ ωα-ωχ B0
FIGURE3.6 – Représentation des niveaux d’énergie dans un système de deux spins
AX
L’orientation des spins dans un système à deux atomes A(flèches vertes) et X (flèches bleues) peuvent être dans le même sens (αα − β β ) ou de sens opposé (αβ − β α). L’éner- gie entre les différents niveaux d’énergie est représentée par la fréquence de Larmor ω des atomes.
Dans un système à deux atomes A et X de spin1⁄2, quatre niveaux d’énergie peuvent être observés en fonction de l’orientation des spins (figure 3.6). Les énergies entre ces dif- férents niveaux sont exprimées à l’aide des fréquences de Larmor des noyaux A et X selon l’équivalence décrite dans l’équation 3.1. Dans un tel système, de l’énergie est nécessaire pour qu’un spin change de niveau d’énergie. La transition α → β est induite par l’impul- sion électromagnétique alors que la transition β → α est induite par les mouvements de la molécule à l’intérieur du champ magnétique principal. Ce mouvement entraîne une va- riation du champ magnétique effectif ressenti par l’atome dû à l’anisotropie de la densité électronique autour de ce dernier. Lorsque la fréquence de cette variation équivaut à la fréquence de Larmor ω, un spin peut relaxer de l’état β vers l’état α.