2.2.1- Matériel de prélèvement
Risques sanitaires liés à la consommation des aliments dans les restaurants:évaluation de la qualité hygiénique de quelques plats de salade servis à Cotonou
19 2.1- Cadre d’étude
Le prélèvement des plats de salade s’est effectué dans certains restaurants de Cotonou et leurs analyses microbiologiques se sont déroulées à la SHEA/SED. Le prélèvement des aliments a été fait à l’aide de matériel de prélèvement approprié.
2.2- Matériels
VerrerieElle est composée des béchers, des erlenmeyers, des tubes à vis stérile, d’une éprouvette graduée, des boites de Pétrie stériles et autres.
Equipements
Ce sont : les étuves, le réfrigérateur, la plaque chauffante muni d’un agitateur magnétique, la balance numérique de précision, le Bain-marie et autres.
Par ailleurs nous avons utilisé aussi les milieux de culture, un coton cardé, la poire d’aspiration, les pipettes, l’alcool et les marqueurs.
2.3- Méthodes 2.3.1- Echantillonnage
Dix (10) échantillons de plats de salade collectés dans 10 restaurants très fréquentés de Cotonou. Ces restaurants ont été sélectionnés au hasard.
2.3.2- Méthode de prélèvement
Le prélèvement des plats de salade a été effectué de façon aseptique après une commande dans chaque restaurant. La commande une fois servie a été introduite dans un sachet de prélèvement stérile dans des conditions d’asepsie. Avec un marqueur, un code a été attribué à chaque échantillon. Tous les sachets ont été mis dans la glacière et ont été acheminés au laboratoire.
2.3.3- Méthodes d’analyse
20 La préparation des milieux de culture s’est faite suivant la prescription du fabricant. A une masse donnée de milieu de culture en poudre, un volume précis d’eau distillée a été ajouté.
Le tout a été porté à ébullition jusqu'à dissolution complète de la poudre. La préparation obtenue a été réparti dans des flacons stériles ou tubes pour être stérilisée à l’autoclave à 121ºC pendant 15 minutes.
2.3.3.2-. Analyses microbiologiques
2.3.3.2.1- Préparation de la suspension mère et des dilutions décimales La suspension-mère est la dilution à partir de laquelle les autres dilutions décimales successives ont été réalisées. Elle a été réalisée en ajoutant à 25g de salade, 225g d’EPT. Après la préparation de la suspension mère, 1mL de cette-dernière a été prélevé et 9 mL de TS y ont été ajoutés pour obtenir la dilution 10-2 et ainsi de suite jusqu'à obtention de la dilution désirée.
2.3.3.2.2- Dénombrement des germes
Flore Aérobie Mésophile Totale (NF EN ISO 4833)
Pour chacun des échantillons dans lesquels la FAMT a été dénombrée, 1mL de chacune des deux dilutions décimales successives retenues a été prélevé à l’aide d’une pipette graduée stérile et introduit respectivement dans deux boîtes de Pétri stériles. Environ 15mL de la gélose Plate Count Agar (PCA) y ont été ajoutés. L’ensemble a été homogénéisé et laissé solidifier.
Après solidification, environ 5mL de la même gélose y ont été coulés pour réaliser une 2ème couche. L’incubation s’est déroulée à 30°C pendant 72h±2h. Toutes les colonies sont comptées.
Coliformes totaux (NFV 08-050)
Pour chacun des échantillons dans lesquels les coliformes totaux ont été dénombrés, 1mL de chacune des deux dilutions décimales successives a été introduit au moyen d’une pipette graduée stérile dans deux boîtes de Pétri stériles. Environ 15mL de la gélose Lactosée Biliée au Cristal Violet et au Rouge Neutre (VRBL) ont été coulés sur l’inoculum. L’ensemble a été homogénéisé et laissé solidifier. Une 2ème couche d’environ 5mL de VRBL a été réalisée.
L’incubation s’est faite à 30°C pendant 24h±2h. Les colonies caractéristiques des coliformes totaux sont de couleur rouge (au vin).
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Eschérichia coli ((ISO 16649-2)
Pour le dénombrement de Escherichia coli, un volume de 1mL de chacune des deux dilutions décimales successives retenues a été introduit au moyen de pipette graduée stérile dans deux boîte de Pétri stériles. Environ 20mL de la gélose Tryptone Bile X-glucuronide (TBX) ont été coulés sur l’inoculum. L’ensemble a été homogénéisé et laissé solidifier. Ces boîtes ont été incubées à 44°C pendant 24h±2h. Les colonies caractéristiques d’E. coli sont bleues.
Staphylocoques à coagulase positive (NFV 08-057)
Les deux dilutions décimales successives retenues ont été utilisées pour dénombrer les staphylocoques à coagulase positive dans les échantillons. Un volume de 0,5mL de chacune des dilutions a été ensemencé en surface par stries dans une boite de Pétri stérile contenant préalablement la gélose Baird-Parker (BP) enrichie au jaune d’œuf et au tellurite de potassium.
L’incubation a été réalisée à 37°C pendant 48h±2h. Après incubation, les colonies noires avec ou sans halo clair ont été utilisées pour rechercher la staphylocoagulase libre. Pour ce faire, 3 colonies caractéristiques et 3 colonies non caractéristiques ont été ensemencées chacune dans environ 3mL du Bouillon Cœur-Cervelle. Les suspensions bactériennes obtenues ont été incubées à 37°C pendant 22h±2h.
Après incubation, 0,3mL du plasma de lapin ont été ajouté à 0,1mL de chacune des suspensions bactériennes dans des tubes à hémolyse stériles. L’ensemble a été incubé à 37°C pendant 5h à 19h. La réaction positive s’est manifestée par la prise en masse du mélange au fond du tube.
Aérobies Sulfito-Réducteurs (XPV 08-061)
Deux dilutions décimales successives retenues ont été utilisées pour dénombrer les ASR. Pour ce faire1mL de chacune d’elles a été introduit dans deux tubes à vis stérile puis environ 22mL de la gélose Tryptone Sulfite Néomycine (TSN) y ont été ajoutés puis l’ensemble a été homogénéisé doucement jusqu’à disparition complète de bulles d’air. Les tubes ont ensuite été laissés solidifier. Après solidification, environ 3mL de la même gélose y ont été de nouveau coulés pour créer l’anaérobiose. Les deux tubes d’ASR ont été ensuite incubés à 46°C pendant 20H±2H. La présence d’ASR se traduit par l’apparition de taches noires dans la gélose.
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Recherche des salmonelles (NF EN ISO 6579) Elle s’est faite en six (06) étapes :
Pré enrichissement
Le pré enrichissement a été fait en diluant 25g de l’échantillon de salade dans 225g d’EPT (pour la revivification). Après homogénéisation, l’incubation a été réalisée à 37°C pendant 18h±2h.
Enrichissement
Nous avons ensemencé 0,1mL du bouillon pré-enrichi dans 10mL de bouillon Rappaport Vassiliadis et nous avons incubé à 41,5°C pendant 21h±3h. Parallèlement nous avons ensemencé 2mL du bouillon pré-enrichi dans 20mL de bouillon Müller Kaüffmann et incubé à 37°C pendant 21h±3h.
Isolement sélectif
Une œse de chacun des bouillons enrichis a été ensemencée par stries respectivement sur les géloses XLD et Hecktoen. L’incubation s’est effectuée à 37°C pendant 21h±3h. Les colonies suspectes de salmonelles sur XLD sont de couleur rouge avec ou sans centre noir et sur Hecktoen, elles sont de couleur verte avec ou sans centre noir.
Recherche de l’Uréase ou test de discrimination
La moitié d’une colonie suspecte isolée sur XLD ou Hecktoen a été émulsionnée dans un tube à hémolyse contenant environ 3ml de bouillon urée-indole. L’incubation a été réalisée à 37°C pendant 4 à 24h. Les salmonelles étant uréase négative, seules les colonies ayant donnée un résultat négatif ont été retenues pour la suite des tests. Le résultat positif s’est manifesté par l’apparition d’une coloration rose ou rouge.
Purification
La seconde moitié de la colonie uréase négative a été ensemencée sur une plaque de gélose nutritive. L’incubation s’est faite à 37°C pendant 21h±3h.
Identification biochimique
Elle a consisté à rechercher un certain nombre de paramètres sur le portoir réduit et à faire la galerie API 20E.
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III- RESULTATS ET DISCUSSION
24 3- Résultats
3.1-Fréquence relative des catégories de plats de salade analysés
Une analyse minutieuse des différents plats collectés révèle que les plats de Salade de Fromage Peuhl (SFP) et de Salade de Betterave au Jambon de Volaille (SBJV) étaient représentés à 30% respectivement chacun tandis que les plats de Salade de Coquillettes aux Saucisses (SCS) étaient présents à 40%.
Figure 2: Fréquences relatives des catégories de plats analysés
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25 3.2- Répertoire des ingrédients identifiés dans les plats de salade collectés
Les résultats montrent que divers ingrédients sont utilisés dans la préparation des différents des plats (tableau 6). L’analyse su tableau révèle que la matière première principal est la laitue. En fonction du plat, les autres ingrédients varient. Le nom donné au plat correspond dépend alors de ces autres éléments.
Tableau 6: Principaux ingrédients retrouvés dans les plats
Types de salade Ingrédients de base
Salade de fromage peuhl Feuilles de laitue, découpe de fromage peuhl et épices
Salade coquillettes aux saucisses Coquillettes, saucisses, feuilles de laitue, épices
3.3- Caractéristiques microbiologiques des plats de salades analysés
Les analyses microbiologiques ont révélé une forte contamination des échantillons par divers groupes de microorganismes. Il s’agit des coliformes totaux, de Escherichia coli β-glucuronidase positive et de Staphylocoque à coagulase positive. En ce qui concerne bactéries anaérobie sulfito-réductrices seulement deux des échantillons ont présenté valeurs hors normes (tableau 6). Ce tableau révèle que tous les échantillons des Salade étaient de qualité hygiénique non satisfaisante. Par contre, la flore totale est dénombrée à des valeurs inférieures à la norme tandis que les salmonelles sont absentes dans tous les échantillons.
26 Tableau 7: Caractéristiques microbiologiques des échantillons des plats de Salade
MICROORGANISMES (UFC/mL)
Echantillons FT CT E.c Staph+ ASR Salmonelles
Plats de Salade de Fromage Peuhl (PSFP)
PSFP a 8,9.105 6,5.102 <10 <10 <10 Abst
PSFP b 8,1.105 6,9.102 <10 <10 <10 Abst
PSFP c 2,5.105 1,5.103 > 3.103 <10 <10 Abst
Plats de Salade de Coquillettes aux Saucisses (SCS)
PSCS a 1,3.104 7,1.102 < 10 < 10 <10 Abst
PSCS b 1,4.104 7,8.102 <10 <10 <10 Abst
PSCS c 1,2.105 7,4.102 <10 <10 <10 Abst
PSCS d 3,4.104 6,0.102 <10 <10 1,5.102 Abst
Plats de Salade de Betterave au Jambon de Volaille (PSBJV)
PSBJV a >3.106 >3.104 <40 <10 <10 Abst
PSBJV b >3.106 >3.103 < 40 <10 1,3.103 Abst
PSBJV c 1,9.105 7,2.102 > 3.103 <10 <10 Abst
Normes m : 107 m : 10 m : 10 m : 102 m : 103 Absent
M : 108 M : 102 M : 102 M : 104 M : 104 dans 25g
FT: Flore Totale ; CT : Coliformes Totaux ; Ec : Escherichia coli β-glucuronidase positive ; Staph+ : Staphylocoque à coagulase positive ; ASR : Anaérobie Sulfito-Réducteurs ; Sal : Salmonelles.
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27 3.4- Discussion
Les résultats de cette étude montrent que divers ingrédients entrent dans la production des différents plats de salade. Il s’agit des feuilles de laitue, des découpes de fromage peuhl, coquillettes, des saucisses, de la betterave, du jambon de volaille et des épices. Chacune de ces matières premières et/ou les opérations unitaires mises en œuvre lors de la préparation des plats peut être à l’origine de la contamination observée. Le niveau de contamination microbiologique élevé de certains échantillons par S. aureus ainsi que E. coli expose le consommateur à des affections d’origines alimentaires telles les infections, les toxi-infections et les intoxications alimentaires (Boubendir, 2014).
En effet, l'intoxication alimentaire staphylococcique est due à des entérotoxines produites par plusieurs espèces de Staphylococcus (principalement S. aureus). Il y a cinq types de toxines (les types A à E) qui, de façon caractéristique, provoquent des vomissements, et souvent de la diarrhée, peu de temps après l'ingestion de la nourriture contaminée. Les toxines sont thermostables et ne sont pas inactivées par le chauffage ou la cuisson de l'aliment. Les toxines sont stables aussi aux pH extrêmes, à l’action des protéases et des radiations. De ce fait une fois formées dans l'aliment, elles sont impossibles à enlevées (Boubendir, 2014).
Le traitement des résultats des analyses microbiologiques a montré qu’en considérant la flore totale, tous les échantillons sont conformes à la norme. Ces résultats diffèrent de ceux obtenus par LACHHAB, (2013), qui a obtenu un pourcentage de 21,45% d’échantillons conformes. En effet, ceci pourrait s’expliquer par une bonne maitrise du processus d’assainissement lors de l’élaboration de ces différents plats de salade servis dans les restaurants de Cotonou. Selon le Laboratoire Départementale d’Analyses (2010), la flore totale est un indicateur du niveau d’Hygiène et de bonne maitrise du processus de fabrication.
La non-conformité vis-à-vis des Coliformes Totaux a révélé un pourcentage de 100%. Ces résultats ne concordent pas avec ceux obtenus par BAUTISTA et ces collaborateurs (2013) qui avaient rapporté une charge de 4,1% de bactéries coliformes sur 220 échantillons de plats de salades. La charge microbienne élevée des coliformes totaux pourrait être le résultat d’un traitement thermique inefficace des différentes composantes des plats de salades, de mauvaises méthodes de désinfection ou, la présence de végétaux crus mal lavé ou mal décontaminé. A Cotonou les légumes feuilles et fruits sont cultivés en plein air. Les légumes sont généralement exposés à la contamination microbienne par leur contact avec le sol, la poussière, l’eau et, les différentes méthodes de récoltes ou les traitements post récoltes. Par conséquent, ils hébergent
28 différents types de microorganismes pathogènes pour l’homme et, pour la plante elle-même (FAO (2007). Les sources possibles de ces pathogènes sont le sol, les fèces (animal et humaine), l’eau (irrigation, nettoyage), les animaux (y compris les insectes et les oiseaux), la gestion des produits, la récolte et les équipements de traitement et, de transport (Adjrah et al, 2011).
Toutefois, en ce qui concerne les ASR, un seul échantillon non conforme a été observé. La contamination par les ASR même si elle est faible, suffit largement pour constituer un risque pour le consommateur. En fait la présence d’ASR est un indicateur témoignant d’une contamination tellurique non maîtrisée par les traitements technologiques (LDA, 2010) et résulterait de la Matière première contaminée et d’un défaut de refroidissement.
En somme, en considérant tous les germes ayant fait l’objet de notre étude, 100 % de nos échantillons étaient de qualité hygiénique non satisfaisante. Ce résultat ne concorde pas avec ceux de LACHHAB en 2013 qui a obtenu 69 % d’échantillon non conforme et ceux d’EL MARNISSI et collaborateurs (2012) qui avaient noté un pourcentage de non- conformité de 32,70%. La non-conformité élevée que nous avons notée, pourrait être liée à un défaut d’hygiène aussi bien corporelle, que vestimentaire, technique et locale (ALAMI et al, 2013).
Selon Ababouch en 1995, la contamination des aliments par la flore totale et les coliformes fécaux dénote respectivement du non-respect des règles de bonnes pratiques et du manquement aux règles d’hygiène. La même observation a été faite par le Laboratoire Départementale d’Analyses (2010). Les consommateurs sont donc exposés à des risques de toxi-infections alimentaires.
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