Le BNP est exprimé dans les oreillettes et les ventricules, mais il est principalement sécrété par les ventricules. La cause principale conduisant à sa sécrétion est le stress mécanique, où les niveaux d’ARNm du BNP sont fortement augmentés en réponse à la surcharge cardiaque.
Le BNP peut alors être considéré comme un marqueur spécifique du myocyte permettant d’identifier les altérations dans l’expression des gènes cardiaques couplés à une surcharge mécanique.
4.1. Localisation et sécrétion du BNP dans le cardiomyocyte normal et pathologique
Dans les conditions normales, la concentration myocytaire de BNP est prédominante dans les cardiomyocytes auriculaires. Suite à une dysfonction ventriculaire, ce peptide augmente alors dans les myocytes auriculaires et ventriculaires avec une augmentation de sa concentration plasmatique (Luchner A. et al., 1998).
Le niveau plasmatique du BNP est faible chez les sujets sains et la sécrétion de ce peptide augmente proportionnellement en fonction de la sévérité de la dysfonction ventriculaire. Cela suggère que la sécrétion du BNP est principalement régulée par le stretch mécanique du ventricule et que son taux plasmatique est un marqueur du degré de la dysfonction ventriculaire gauche (Yasue H. et al., 1994).
4.2. Expression du BNP dans le cardiomyocyte normal et pathologique
A l’exception des rats et des souris où l’expression du gène du BNP est présente dans le ventricule gauche normal, ce peptide, dans les conditions normales, n’est exprimé que dans les oreillettes chez les félins, les lapins et les chiens (Biondo AW. et al., 2003). Une nouvelle expression ventriculaire du gène du BNP est décelée dans l’hypertrophie ventriculaire.
Dans un cœur sain, l’expression du gène du BNP dans le tissu cardiaque est limité aux oreillettes et augmente en cas d’une dysfonction ventriculaire accompagnée d’une augmentation dans l’expression du gène du BNP au niveau du ventricule gauche, associée
à une augmentation de l’expression myocytaire et plasmatique de ce peptide (Luchner A et al., 1998).
4.3. Récepteurs peptidiques dans le cardiomyocyte normal et pathologique
Le BNP est un modulateur important paracrine/autocrine de la croissance et du remodelage cardiaque. L’activité biologique du BNP est induite par sa liaison sur ses récepteurs peptidiques particulièrement sur son récepteur NPR-A. Dans les cardiomyocytes normaux, les trois récepteurs peptidiques (NPR-A, -B et –C) sont exprimés et leur expression varie suite à une surcharge de pression, de volume ou une hypertension. Dans les cardiomyocytes ventriculaires hypertrophiés, on assiste à une modulation de l’expression des gènes des NPRs. En effet, une délétion du gène du NPR- A dans les myocytes cardiaques de souris provoque une hypertrophie cardiaque et une fibrose dès la naissance (Christoffersen TE. et al., 2006). Alors que le traitement de cardiomyocytes néonataux en culture avec du BNP réduit l’induction de l’hypertrophie. Donc le circuit de signalisation BNP/GC-A régule l’hypertrophie et antagonise la croissance myocytaire (Molkentin JD., 2003).
4.4. BNP et ICaL dans le cardiomyocyte normal et pathologique
Peu de données récentes ont été élaborées concernant l’effet du BNP sur le courant calcique. Il est déjà connu que dans des conditions physiopathologiques comme l’hypertrophie cardiaque, des changements marqués dans la contraction des myocytes sont décelés. Ces anormalités contractiles sont accompagnées par des altérations de la concentration du calcium intracellulaire (Balke CW. et al., 1997) ainsi qu’une prolongation de la durée du potentiel d’action (APD) dans les modèles expérimentaux ainsi que chez les humains (Lebeche D. et al., 2006).En parallèle, il y a expression et sécrétion de BNP dans ces conditions physiopathologiques.
Le BNP est connu comme modulateur de la fonction cardiaque. Il diminue la contractilité myocytaire via la voie de signalisation du GMPc. En effet, suite à la fixation du BNP sur son récepteur à GC, il y a diminution de la translocation nucléaire des facteurs de transcriptions qui influence l’expression des gènes dont le gène de la SERCA
(Kögler H. et al., 2006), et augmentation de la production de GMPc qui va activer la PKG-I. Parce que la diminution de l’expression de la SERCA est importante pour la physiopathologie, le BNP peut affecter l’expression SERCA et l’homéostasie calcique.
Il a déjà été démontré que le GMPc inhibe le courant calcique de type L, ICaL, par
phosphorylation des canaux calciques par la PKG-I (Sumii K. et al., 1995). La surexpression de PKG-I réduit l’amplitude de l’ICa transitoire dans les cardiomyocytes, ce qui pourrait expliquer l’effet inotrope négatif exercé par le BNP dans le cardiomyocyte pathologique.
4.5. BNP biomarqueur des pathologies cardiaques
La mesure du BNP et du NT-proBNP plasmatique a été développée pour sa valeur diagnostique et pronostique dans les pathologies cardiaques. Bien que le rôle des hormones cardiaques dans l'identification et la gestion des individus ayant une dysfonction ventriculaire asymptomatique reste à être clarifiée (Vasan RS. et al., 2002), l'utilité clinique des tests de BNP ou de NT- proBNP pour le dépistage des pathologies cardiaques (Nakamura M. et al., 2002), pour la stratification des patients ayant une insuffisance cardiaque (HF) (Koglin J. et al., 2001), pour la détection de la dysfonction ventriculaire gauche diastolique et / ou systolique (Lubien E. et al., 2002), et pour le diagnostic différentiel de la dyspnée (Morrison LK. et al., 2002 ; Cabanes L. et al., 2001), a été confirmé récemment. Il a été suggéré que le test du BNP peut être cliniquement utile (Clerico A. et al., 1999 ; Cardarelli R. et al., 2003 ; Richards AM. et al., 2002 ; McCullough PA. et al., 2003) pour le dépistage et la classification des patients ayant une insuffisance cardiaque, comme marqueur dans les pathologies cardiaques, pour le suivi des patients ayant une insuffisance cardiaque, et pour éviter ou réduire la nécessité des enquêtes coûteuses et / ou inutiles.
4.5.1. Utilité diagnostique du BNP
Deux études récentes (Vasan RS. et al., 2002 ; Nakamura M. et al., 2002) ont permis d’évaluer la précision diagnostique du dosage du BNP comme méthode de dépistage dans l’ensemble d’une population. La première étude la Framingham Heart Study Cohorte a analysé 3177 personnes, en utilisant le BNP dans l'évaluation de
l'hypertrophie ventriculaire gauche et la dysfonction systolique dans une communauté de la population (Vasan RS. et al., 2002). Le but de la seconde étude était d’évaluer la validité des mesures plasmatiques de BNP pour la détection de différentes anomalies cardiaques dans une population japonaise rurale.
L'étude japonaise a suggéré que le dosage du BNP était une technique de dépistage très efficace et rentable pour identifier les patients ayant diverses anomalies cardiaques, quels que soient l'étiologie et le degré de dysfonction ventriculaire gauche systolique (Nakamura M. et al., 2002) ; alors que l'étude de Framingham a suggéré une utilité limitée des tests de BNP comme outils de dépistage des dysfonctions ventriculaires, en particulier chez les femmes (Vasan RS. et al., 2002).
Ces deux études, prises ensemble, indiquent que le dosage du BNP seul a une utilité limitée comme méthode de dépistage de l’insuffisance cardiaque dans l’ensemble d’une population en raison de la mauvaise sensibilité. Toutefois, ces deux études pourraient suggérer que le dosage du BNP peut être utilisé pour exclure une insuffisance cardiaque chez des individus asymptomatiques(Clerico A. et al., 2004).
4.5.2. Utilité pronostique du BNP
Dans la plupart des études réalisées sur des patients souffrants de pathologies cardiaques, le BNP ou le NT-proBNP plasmatique ont toujours été trouvé être des marqueurs de risque de morbidité et/ou mortalité. En effet la concentration de BNP plasmatique reflète différents stades pathologiques et est prédictive de mortalité. Chaque augmentation de 50 ng/L de la concentration de BNP plasmatique est associée à une augmentation de 1.6 fois du risque d’événements cardiaques et de 1.4 fois de mortalité. Goto et al., 2002, ont cherché à déterminer sur une durée de 12 mois chez 53 patients en cours d’hémodialyse chronique sans symptômes cliniques de désordres cardiaques, si l’augmentation des concentrations plasmatiques de BNP prédit des événements cardiaques. Ils ont alors trouvé que l’incidence d’événements cardiaques était significativement plus grande chez les patients ayant des concentrations élevées de BNP.
D’un autre côté, Miller et al., 2007, ont démontré récemment l’importance de la variation du BNP avec le temps. La mesure du BNP chaque trois mois chez 190 patients insuffisants cardiaques montre non seulement que l’augmentation de la concentration de
BNP à tout moment est en corrélation avec un empirement du résultat mais aussi qu’une fois augmenté, d'autres changements dans le BNP demeurent associés à des événements indésirables.
4.5.3. Utilité thérapeutique du BNP
L’administration de BNP a été perçue comme une approche thérapeutique intéressante de l'insuffisance cardiaque. Le BNP diminue la pression artérielle et augmente le volume urinaire et l’excrétion sodique sans activation adverse neurohumorale.
En 2001, la FDA (US Food and Drug Administration) a approuvé l’utilisation de la protéine recombinante du BNP humain, le nesiritide, dans le cas d’insuffisance cardiaque en se basant sur les essais comparatifs publiés par Colucci et al., 2000, et qui ont montré que les patients insuffisants cardiaques qui recevaient le nesiritide montraient une amélioration dans leur état global avec une diminution de la pression sanguine et une augmentation du taux urinaire ; ainsi que la dyspnée et la fatigue étaient également réduits (de Sa DD. et al., 2008).
D’un autre côté, il y a eu des données contradictoires concernant le nesiritide. Des analyses réalisées sur des patients insuffisants cardiaques ont suggérés que le nesiritide pourrait nuire à la fonction rénale, et développer même une insuffisance rénale (Sackner- Bernstein JD. et al., 2005 ; Costanzo MR. et al., 2007).
Suite à ces données, l’utilisation du nesiritide comme thérapie pour les patients insuffisants cardiaques aux Etats-Unis a diminué de 16.6% en mars 2005 à 5.6% en décembre 2005. Des études cliniques et préclinique ont suggéré que l’absence d’effets bénéfiques du nesiritide au niveau rénal peut être dû aux doses utilisées qui pourraient induire une hypotension et alors diminuer la pression de perfusion rénale (Riter HG. et al., 2006). Une autre explication possible pourrait être liée à la sévérité de l’insuffisance cardiaque.
En effet, dans des modèles humains et animal ayant une insuffisance cardiaque sévère, il y a une diminution de la réponse au BNP. La diminution de la réponse rénale au BNP joue un rôle important dans la pathophysiologie de la rétention sodique et la vasoconstriction rénale observée dans l’insuffisance cardiaque sévère. Plusieurs
mécanismes sont responsables de la faible réponse rénale au BNP dont la diminution de la pression de perfusion rénale, l’augmentation de l’activité nerveuse sympathique rénale, la diminution de l’expression du NPR-A ainsi que la production de GMPc, l’augmentation de la dégradation du BNP par la NEP, et l’augmentation de l’activité du RAAS.
De même, des études récentes suggèrent que le nesiritide pourrait être associé à l’augmentation du risque de mortalité suite au traitement de patients insuffisants cardiaques (Sackner-Bernstein JD. et al., 2005).
Bien que l'efficacité du BNP exogène dans l'amélioration des symptômes et de l'hémodynamique dans l’insuffisance cardiaque a été bien défini, des études prospectives seront requises afin de définir son effet sur la mortalité et la fonction rénale.
MATERIEL ET METHODES
e travail a été mené sur des rats adultes mâles de souche Wistar ayant un poids de 250 ± 50 g. Les rats ont été divisés en deux groupes :
- Le groupe H où les rats ont subi chirurgicalement une sténose à 50% de l’aorte abdominale afin d’induire une hypertrophie cardiaque par surcharge de pression ;
- Le groupe N où les rats ont subi uniquement l’intervention chirurgicale sans toutefois ligaturer l’aorte abdominale.
Après 12 semaines, les cardiomyocytes ventriculaires ont été isolés par digestion enzymatique des coeurs prélevés sur les rats des 2 groupes. Suite à cette étape, les cellules fraîchement dissociées seront utilisées pour plusieurs fins :
- Etude électrophysiologique du courant calcique de type L à l’aide de la technique du patch clamp ;
- Mises en culture primaire pour l’évaluation par cytofluorimétrie laser de la concentration de calcium intracellulaire [Ca2+]i ;
- Conservation à -80°c pour l’analyse ultérieure de l’expression des gènes des NPRs par RT-PCR ;
- Etude par la technique ELISA de l’activité du GMPc intracellulaire.
Parallèlement des analyses biochimiques sur des échantillons de plasma et de milieu de culture ont été effectué ainsi qu’une évaluation anatomopathologique et immunohistochimique du cœur hypertrophié.
1. Induction de l’hypertrophie – Procédure chirurgicale
1. 1. Anesthésie du rat
L’anesthésie se fait par injection intrapéritonéal d’un mélange de kétamine (75 mg/kg) et de xylazil (10 mg/kg).
1.2. Sténose de l’aorte abdominale
L’animal est placé sur une table chauffante thermostatée, la peau et les muscles de l’animal sont sectionnés sur la face ventrale au niveau abdominal sur environ 3 cm.
L’animal est cambré. Les organes gênants à l’accès au pilier du diaphragme sont écartés avec précaution. Le pilier est déchiré à l’aide d’une pince à mors. L’aorte abdominale est repérée et débarrassée par la suite des petits fragments musculaires qui y adhèrent et de la veine cave, puis elle est soulevée légèrement de façon à pouvoir placer le fil qui est alors serré à 50% au niveau de la dernière vertèbre lombaire sous les reins. Les organes sont remis en place et le muscle et la peau sont ensuite recousus avec du fil de lin. Le fil est gardé pendant 12 semaines avant de sacrifier les rats, période suffisante pour développer une hypertrophie cardiaque modérée.
2. La dissociation cellulaire
2.1. Prélèvement du cœur
Après avoir anesthésié et hépariné (5000 UI/kg) le rat en intrapéritonéal, l’animal est placé en décubitus dorsal. Une thoracotomie est alors effectuée et le coeur est rapidement prélevé et pesé puis plongé dans un bêcher remplie de Tyrode à 4°C (solution I, Figure MM1).
Dans une cuve remplie de la même solution, le tissu adipeux est enlevé et le coeur est canulé au niveau de l’aorte à l’aide d’une seringue contenant la solution I à 4°C. Ainsi les coronaires sont lavées et ensuite l’ensemble coeur-canule est mis sur la colonne de Langendorff.
2.2. Digestion enzymatique-Technique de Langendorff
La dissociation des cardiomyocytes ventriculaires se fait par perfusion rétrograde du coeur à travers les coronaires (technique de Langendorff) par une solution physiologique contenant de la collagénase type V (Sigma).
L’étape de la digestion se déroule en 4 temps successifs en utilisant 4 solutions différentes (Figure MM1) maintenues à 37°C à l’aide d’un bain marie thermostaté.
1er Temps : perfusion pendant 2 mn avec la solution I pour que le coeur récupère son activité spontanée.
2nd Temps : passage à la solution II pendant 3 à 4 mn pour arrêter les battements cardiaques et fragiliser les ciments intracellulaires.
3ème Temps : perfusion pendant 10 à 15 mn avec la solution enzymatique III. 4ème Temps : lavage du coeur avec la solution IV pendant 2mn
Prélevé de la colonne, les ventricules sont découpés en petits morceaux dans des boites de Pétri contenant du milieu KB (Kraft Bruh ou « power soup ») (Figure MM2). Les cellules sont ensuite libérées mécaniquement en faisant agiter les bouts à l’aide d’une pipette pasteur rodée à la flamme. L’ensemble milieu KB et cellules sont filtrés sur toile à bluter (Ø=200µm) et laissés décanter pendant une heure.
Solution I Tyrode normale
Solution II 0Ca–EGTA
Solution III Tyrode Enzymatique Solution IV Tyrode modifiée NaCl 140 140 140 140 KCl 5,4 5,4 5,4 5,4 CaCl2 1,8 - 0,07 0,07 MgCl2 1,8 1,8 1,8 1,8 HEPES 10 5 5 5 Glucose 11 10 10 10 EGTA - 0,1 - - Taurine - 20 20 20 BSA - - 1 g/l 1 g/l Collagénase - - 0,3 mg/ml - Rouge de phénol - - 5 mg 5 mg
pH 7,4 (Tris) 7,2 (Tris) 7,2 (Tris) 7,2 (Tris)
Figure MM1 : Composition (en mM) des solutions physiologiques utilisées dans la dissociation cellulaire
KB KCl 70 K-glutamate 5 KH2PO4 20 MgSO4 5 CaCl2 0,08 EGTA 0,5 Créatine 5 Na2ATP 5 Taurine 20 HEPES 10 Glucose 10 pH 7,23 (KOH)
Figure MM2 : Composition (en mM) de la solution de KB
3. Culture primaire des cardiomyocytes
Dans un milieu défini proche des conditions physiologiques et l’utilisation d’un environnement physico-chimique contrôlé, il est possible de maintenir vivante hors de l’organisme des cellules non organisées en tissu. Ces cellules sont capables de conserver tout ou partie de leur métabolisme et leur fonction spécifique observée in vivo.
Le protocole de mise en culture dérive du modèle « d’attachement rapide » utilisé par N.FARES et coll., 1996. Selon ce modèle, les cellules sont maintenues en survie dans le milieu de culture M199 et dépourvu de tout apport de facteurs sériques permettant de garder les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles d’une cellule cardiaque adulte différenciée.
Après une heure de décantation des cellules dans le milieu KB, le surnageant est enlevé et remplacé progressivement par des quantités croissantes de milieu de culture M199 afin de retrouver la concentration physiologique du calcium. Le mélange cardiomyocytes / milieu M199 est centrifugé et le surnageant est jeté et remplacé par du M199 additionné de 1% de CCT (Créatine-Carnitine-Taurine), 1% d’insuline et 1% d’antibiotique (Stréptomycine). Les cellules sont ensuite ensemencées à la densité de 200.103 / ml par boîte de Pétri et placées dans un incubateur (95 %O2, 5%CO2) à 37°C. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 48 h.
4. Technique de Patch Clamp: Etude électrophysiologique du courant calcique de type L
L’enregistrement du ICaL sur les cardiomyocytes ventriculaires a été effectué à l’aide de la technique du patch-clamp. Cette technique permet d’enregistrer les courants électriques de l’ordre de picoampère, pA ou nanoampère, nA transitant par les canaux ioniques transmembranaires. Elle fut introduite par Neher et Sackmann en 1976 et décrite dans sa forme améliorée par ces mêmes auteurs (Hamill et al.,1981) , ce qui leur a valu le prix Nobel de Médecine et de Physiologie en 1991.
4.1. Principe
La technique consiste à isoler électriquement une portion de membrane cellulaire en appliquant sur la membrane une électrode de verre (dont le diamètre à la pointe est de l’ordre de 1 µm) remplie de liquide conducteur. La membrane accolée au verre de la pipette par un phénomène physico-chimique permet un scellement étroit ou « seal » de haute résistance (de l’ordre de 10 à 100 GΩ). Celui-ci est nécessaire afin d’amener la majeure partie des courants ioniques traversant la membrane de la cellule, à transiter par la pipette jusqu’au système d’enregistrement. Cette haute résistance permet aussi de réduire le bruit de fond qui masque le signal biologique recherché et permet d’imposer un potentiel donné (Voltage-Clamp) à une portion de la membrane isolée sous la pipette ou bien à la cellule entière.
Cette technique permet de déterminer la capacité membranaire de la cellule et d’enregistrer les courants à l’échelle unitaire ou globale dans quatre types de configurations électriques (Figure MM3) :
La configuration « cell-attached » ou « cellule attachée », est obtenue par la formation du « giga seal ». Les courants ioniques sont enregistrés au niveau de la portion de membrane, isolée du reste de la cellule, sous la pipette ;
La stabilité mécanique du « giga seal » permet d’obtenir la configuration « inside- out » ou « dedans-dehors », en appliquant un léger retrait de la pipette, la portion de membrane sous la pointe de la pipette est excisée du reste de la cellule. Elle est maintenue avec la face interne (ou cytoplasmique) vers le milieu extérieur. Lors de l’arrachement cette portion de membrane peut se refermer pour former une vésicule qui est ensuite ouverte par une brève exposition à l’interface air/liquide ;
La configuration « Whole-Cell Recording » (WCR) ou « cellule entière, est obtenue à partir du stade « cell-attached » par l’application d’une succion supplémentaire. Lorsque la membrane est rompue, le milieu intrapipette peut diffuser dans le milieu intracellulaire. Cette configuration permet d’enregistrer l’ensemble des courants traversant la membrane ;
La configuration « outside-out » ou « dehors-dehors » est obtenue également à partir de la configuration « Whole-Cell Recording » ou par éloignement de la pipette, une portion de membrane est attachée pour former une demie vésicule à la pointe de la pipette avec la partie externe de la membrane à l’éxterieur.
Il est à noter qu’avec les configurations cell-attached, inside-out et outside- out nous mesurons des courants unitaires transitant par un ou deux canaux, alors qu’avec la configuration Whole-Cell Recording nous enregistrons des courants macroscopiques.
Figure MM3 : Les différentes configurations de la technique du patch clamp
4.2. Dispositif expérimental a) Système de microscopie
L’observation des cellules lors des manipulations ainsi que le contrôle visuel de l’approche du système de périfusion et de la pipette de patch s’effectuent à l’aide d’un microscope optique en phase inverse à vision binoculaire et en contraste de phase.
b) Circuit électronique
Il est constitué d’un amplificateur de patch-clamp (Axopatch 200A, Axon Instruments USA) possédant un convertisseur courant-tension avec deux résistances de feed-back (10 GΩ ou 100 GΩ). L’amplificateur possède en plus trois autres fonctions principales :
- La correction du potentiel de jonction ; - La compensation de la résistance série ; - La compensation des courants capacitatifs.
c) Système informatique