Biologie moléculaire

Le rôle de la sérologie dans le diagnostic de l'uvéite est limité, bien que certaines études aient montré l'utilité du coefficient de Goldmann Witmer pour le diagnostic de la toxoplasmose avec une sensibilité de 60 à 92 %; la disponibilité de petits échantillons limite leur utilité. L'isolement de la culture cellulaire prend beaucoup de temps et manque de sensibilité en raison de la faible charge pathogène dans les échantillons oculaires. La quantité limitée d'échantillons intraoculaires et la nécessité d'un diagnostic précoce pour prévenir la perte de vision nécessitent l'utilisation de méthodes de laboratoire très sensibles. Parmi les méthodes moléculaires, l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) a gagné l'importance dans le diagnostic car elle fournit la preuve directe de l'infection (en amplifiant directement l'ADN du germe pathogène) et présente une sensibilité et une spécificité élevées. Pour résoudre le problème du faible volume d'échantillons, les PCR multiplex ont été largement développés et utilisés. Puisque les tests PCR conventionnels prennent du temps et sont sujets à la contamination, la technologie PCR en temps réel est privilégiée et a également une sensibilité et une spécificité plus élevées. En temps réel, l'utilisation de différents fluorophores avec différents spectres d'émission rend le diagnostic plus spécifique et a également la capacité de quantifier la charge pathogène.

 Extraction d'ADN

L'ADN est extrait d'échantillons d'humeur aqueuse et vitreuse à l'aide d'un kit selon les instructions du fabricant avec de légères modifications.

 Dans le contexte de La détection du génome de Mycobacterium . Certaines équipes utilisent également des sets d’amplification propres à leur

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laboratoire [44,45]. La spécificité de ces tests est bonne. La sensibilité est excellente pour les expectorations où le frottis est positif et modérée dans les cas de frottis négatifs et de tuberculose extrapulmonaire. Ainsi, Arora et al. rapportent que, dans des cas de vascularites rétiniennes et de panuvéites granulomateuses présumées tuberculeuses, les PCR étaient positives dans 33 % et 66,6 % des cas respectivement. Ortega-Larrocea et al ,dans une étude similaire, ont eu dix-sept cas positifs sur vingt-deux (77,7 %) et 8,8 % de faux positifs[46] .

 Malgré cette sensibilité modérée et le risque de faux négatif qu’elle entraîne, la PCR est la seule technique qui permet à l’heure actuelle d’apporter des preuves directes de l’origine tuberculeuse d’une uvéite à partir de prélèvements peu invasifs.

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 Pour la syphilis oculaire, Depuis longtemps, son diagnostic repose sur la positivité de la sérologie sanguine. Celle-ci a pourtant des limites avec les faux négatifs TPHA, VDRL lors de la phase primaire et avec les faux positifs VDRL des sujets VIH et les faux positifs TPHA des sujets guéris. T. pallidum ne se cultivant pas, la PCR en temps réel qui cible l’acide désoxyribose nucléique (ADN) polymérase 1 à l’aide d’une sonde Taqman permet de détecter de faible quantité d’ADN de T. pallidum de façon sensible et spécifique.

Elle est réalisable dans différents milieux biologiques et particulièrement rentable sur le prélèvement d’ulcère génital lors de la phase primaire. Dans l’humeur aqueuse, sa sensibilité semble être augmentée en cas de rétinite ou de panuvéite témoin d’une infection directe par T. pallidum contrairement aux névrites optiques qui seraient plutôt provoquées par une réaction auto-immune. Dans le vitré, elle est de réalisation rapide, et possède une spécificité de 100 % ainsi qu’une forte sensibilité. Dans tous milieux confondus, sa sensibilité est de 53 % et sa spécificité de 100 %

 Pour le diagnostic de toxoplasmose oculaire, la recherche d’IgA spécifiques dans l’humeur aqueuse a été proposée pour améliorer la sensibilité de la détection d’une production locale d’anticorps spécifiques.

Le western blot permettrait également de mettre en évidence la synthèse locale d’anticorps antitoxoplasmique, en comparant les blots obtenus à partir du sérum et à partir de l’humeur aqueuse.

Une synthèse locale est affirmée en cas de différence de profils de bandes entre l’humeur aqueuse et le sérum [47].

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Dans quelques cas, la présence du parasite dans l’humeur aqueuse a pu être affirmée par la détection de l’ADN de T.gondii amplifié par PCR .Selon les études, entre 31 % et 46 % des échantillons d’humeur aqueuse étaient positifs en PCR [48,49] .En revanche, chez les patients immunodéprimés, la technique de PCR pourrait être plus sensible que la recherche d’une production locale d’anticorps.

Certains auteurs proposent une combinaison des techniques disponibles pour améliorer la sensibilité globale de l’analyse de l’humeur aqueuse. Une étude combinée de ces techniques retrouvait une sensibilité de 65 % pour la production intraoculaire d’IgG, de 52 % pour la production d’IgA et de 27 % pour la PCR. La sensibilité globale de la combinaison des tests (au moins un test positif) était de 91 %. Dans une autre étude, la combinaison de trois techniques (coefficient de Desmont, western blot et PCR) augmentait la sensibilité à 97 %.

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Figure 27: Différentes étapes du diagnostic biologique devant une suspicion clinique de TO

Concernant les virus, l’isolement à partir de l’humeur aqueuse ou du vitré est impossible, pour des raisons méconnues : volume d’échantillon insuffisant, faible charge virale, virus intracellulaire, pouvoir infectieux réduit ? La recherche d’antigènes viraux dans ces fluides biologiques n’a pas été développée. Les techniques de PCR sont donc les seules à privilégier.

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L’humeur aqueuse et le vitré n’hébergent aucun des Herpesviridae sous leur forme latente. La présence du génome de l’un de ces virus dans l’humeur aqueuse ou le vitré est donc toujours secondaire à une réplication virale, témoignant d’une infection active productive survenue de façon récente.

La spécificité des tests est donc excellente.

La simple présence d’ADN viral ne donne en revanche aucune indication sur le pouvoir infectieux du virus : c’est une notion à prendre en compte au cours du suivi évolutif des patients sous traitement.

La quantification de la charge virale intraoculaire permet de suivre l’efficacité du traitement antiviral. Le délai moyen de disparition de l’ADN viral des liquides intraoculaires sous l’effet des traitements antiviraux n’est pas établi, mais les données disponibles montrent une persistance de plusieurs semaines au décours d’une nécrose rétinienne à VZV ou HSV [50].

Une résistance clinique au traitement antiviral peut théoriquement découler soit d’un mauvais accès de la drogue au compartiment biologique, soit d’une résistance virologique. Celle-ci est définie par l’élévation des concentrations inhibant la multiplication virale. Les mutations de résistance les plus fréquentes associées à la résistance phénotypique des HSV, VZV, CMV sont cartographiées. Elles siègent dans les gènes codant les enzymes cibles des traitements antiviraux : thymidine kinase (HSV et VZV) ou phosphotransférase (CMV) et ADN polymérase [51]. L’ADN extrait des liquides intraoculaires peut être amplifié pour analyser la séquence de ces gènes Ces analyses sont encore du domaine de la recherche clinicobiologique .

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DIAGNOSTIC