Biologie du battement ciliaire

II.1.1.2. Mécanismes de régulation ... 148 II.1.2. Couplage hydrodynamique entre cils et fluides ... 151 II.1.2.1. Battement d’un cil dans un fluide ... 151 II.1.2.2. Coordination entre plusieurs cils ... 156 II.1.2.2.1. Couplage ... 156 2.2.2. Battement collectif ... 161 II.1.2.3. Transport mucociliaire ... 164 II.1.2.3.1. Génération du transport ... 164 II.1.2.3.2. Impact des propriétés du fluide sur le transport ... 166 II.1.2.3.3. Rôle de l’hétérogénéité de l’activité ciliaire ... 170 II.1.3. Conclusion : complexité et modulation de la coordination ciliaire et du transport associé ... 173

II.2. Méthodes d’acquisition, de traitement et d’analyse des vidéos ... 175

II.2.1. Acquisition du battement ciliaire et du transport du fluide par vidéo-microscopie ... 175 II.2.1.1. Paramètres généraux d’acquisition ... 175 II.2.1.2. Acquisition de l’activité ciliaire ... 175 II.2.1.3. Acquisition du transport du mucus ou du fluide ... 176 II.2.1.4. Mode d’application des drogues et des fluides viscoélastiques ... 177 II.2.2. Article 3 : Traitements des vidéos et analyses des trajectoires de battement ... 179 II.2.2.1. Présentation de l’article 3 ... 179 II.2.3. Calcul du champ de vitesse de transport ... 211

II.3. Caractérisation de l’activité ciliaire et du transport du mucus ... 213

II.3.1. Comparaison entre les cultures BEGM et PneumaCult et entre les trois groupes

de patients ... 213 II.3.2. Quelques exemples sur l’effet de drogues spécifiques ... 215 II.3.2.1. Effet d’une inhibition de la régulation du calcium intra-cellulaire ... 215 II.3.2.2. Impact du tabac ... 218 II.3.3. Impact de la viscoélasticité du fluide ... 221

145

II.3.4. Evolution en fonction de la maturité de la culture ... 223 II.3.4.1. L’activité ciliaire et sa répartition spatiale au cours du temps ... 223 II.3.4.2. Efficacité du transport mucociliaire en fonction de la densité de battement ... 228

II.4. Coordination spatio-temporelle du battement ciliaire ... 231

II.4.1. Caractérisation du battement individuel des cils ... 231 II.4.1.1. Trajectoire spatiale des cils ... 231 II.4.1.2. Fluctuation de la période de battement des cils au cours du temps ... 232 II.4.2. Coordination intra cellules ciliées, types et évolution des mécanismes de

battement ... 234 II.4.3. Coordination inter cellules ciliées ... 241

146

II.1. Etat de l’Art

II.1.1. Biologie du battement ciliaire

II.1.1.1. Structure d’un cil motile et mécanismes du battement

Les cils motiles ou flagelles sont composés d’un cytosquelette de microtubules, nommées axonèmes, et de plus de 250 protéines (Nicastro et al. 2006). Quatre zones peuvent être distinguées dans le cil : la zone basale ancrée dans la cellule ; la zone de transition à la surface de la cellule entre la base et le corps du cil ; le corps du cil ; et l’extrémité du cil (Fisch and Dupuis-Williams 2011; Croft et al. 2018) (Figure 37B).

Figure 37 : Ultrastructure d’un cil motile ou d’un flagelle. A) Schéma de la structure interne du cil en coupe transversale. Image adaptée de Croft et al., 2018. B) Schéma en vue longitudinale de la structure d’un cil motile avec les différentes zones qui le composent, de bas en haut : le corps basal « bb », la zone de transition « tz », la zone centrale « dz » avec les doublets de microtubules (structure 9+2 axomènes), et la zone terminale « sz » avec la terminaison des microtubules. « cr » réfère aux « antennes », nommées ‘ciliary crown’, sur la tête du cil. A droite du schéma longitudinal du cil, des coupes transversales (schéma + image obtenue en microscopie électronique à transmission) illustrent la structure interne de chaque zone. L’ensemble du panneau B) est issu et adapté de Fisch et Dupuis-Williams, 2011.

Le corps du cil. Il y a neuf doublet de microtubule qui forme un cercle autour d’un doublet central,

d’où la structure dite 9+2 axomènes (Croft et al. 2018; Satir 1968; Nicastro et al. 2006; Porter and

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Sale 2000) (Figure 37A). Pour permettre la motilité, les neuf doublets en périphérie sont munis de moteurs moléculaires, composés de protéines de type kinésine II, nommées dynéines. Chaque doublet périphérique comporte un bras de dynéine interne et un externe, afin de rendre le cil flexible (Sartori et al. 2016). Le déplacement de l’extrémité des bras le long des structures de microtubule, grâce à l’hydrolyse de l’ATP, engendre une traction, de l’ordre de 1 pN par bras de dynéine (Shingyoji et al. 1998), et donc une courbure des microtubules (Lindemann 2007; Lindemann and Lesich 2010). Le déplacement coordonné de ces bras de dynéine, le long de la structure du cil et entre la face interne et externe des doublets, permet de mouvoir le cil avec la génération d’une onde de flexion. La force totale exercée par le cil est de l’ordre de 0,1 à 1 nN (Teff, Priel, and Ghebery 2007; Teff, Priel, and Gheber 2008). Des défauts dans la structure du cil, que ce soit dans la construction des microtubules ou dans les bras de dynéines permettant la motilité, entrainent donc une absence de motilité du cil ou un cycle de battement anormal et inefficace. Par exemple, une absence de dynéines internes et externes ou juste externes cause une immobilité totale alors qu’une absence de dynéines internes seulement engendre une perte de la flexibilité du cil, qui bat en restant raide et avec une faible amplitude (Chilvers, Rutman, and O’Callaghan 2003). Ces défauts ne sont pas spécifiques à des patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive, bien que dans ce cas la quasi-totalité des cils présents sont touchés, entrainant la perte du transport mucociliaire (Papon et al. 2012). Ces anomalies sont présentes même chez des patients sains, bien quand faible proportion (<25% des cils) (Kempeneers, Seaton, and Chilvers 2017; Papon et al. 2012), et peuvent augmenter significativement dans le cas de pathologie respiratoire, comme dans l’asthme (Thomas et al. 2010).

La base du cil. La zone basale ancrée dans la cellule est composée de neuf triplets de microtubules,

nommés A, B et C (Figure 37B). Au niveau de la base des cils, un réseau de cytosquelette composé de filaments intermédiaires et de microtubule maintient la base des cils et les relie entre elles dans le tissu (Figure 38) (Tateishi et al. 2017). Ce cytosquelette ancre le cil dans la cellule et lui évite de s’en arracher malgré sa motilité mais peut également jouer un rôle de synchronisation du battement aux sein de la cellules grâce à ce réseau élastique connecté (Wan and Goldstein 2016).

La zone de transition. La zone de transition fait la jonction entre la zone basale du cil à 9 triplets de

microtubules (A, B et C) et le corps du cil à 9+2 doublets de microtubules (A et B). Ainsi, les neuf triplets externes perdent un microtubule, le C, pour devenir des doublets, et le doublet central est créé. C’est une zone complexe, comportant un plan terminal en bas et un plan basal en haut où s’ancre la paire centrale de microtubule, et des fibres reliant les microtubules à la membrane plasmique et au début de la paire centrale. Ces fibres permettent de rattacher la base du cil à la membrane plasmique, mais joue également un rôle de transmission avec des protéines spécifiques, ce qui fait de la zone de transition une zone importante dans la communication, le transport et régulation intra-ciliaire (Fisch and Dupuis-Williams 2011).

L’extrémité du cil. L’extrémité du cil regroupe la terminaison des doublets de microtubules, avec

dans l’ordre la fin du microtubule B, puis du A, et au bout du cil celle de la paire centrale avec la tête du cil à son extrémité. Cette zone peut être plus ou moins longue sur les cils et flagelles en fonction

148

de l’espèce, l’organe et la fonction, avec une longueur différentiée ou non entre les deux microtubules A et B des doublets externes et celle du doublet central (Fisch and Dupuis-Williams 2011; Croft et al. 2018; Satir 1968). La tête du cil peut être équipée de filaments nommés ‘ciliary crown’ (Fisch and Dupuis-Williams 2011) (Figure 37B). Ces filaments, présents sur les cils motiles de l’épithélium respiratoire, servent d’antennes aux signaux optiques, chimiques, osmotiques et mécaniques (Croft et al. 2018; Shah et al. 2009). La tête du cil a donc un rôle majeur dans la régulation intra cellulaire, mais aussi dans la communication inter cellulaire (Fisch and Dupuis-Williams 2011; Croft et al. 2018). Les antennes des cils de l’épithélium des voies respiratoires ont également des récepteurs spécifiques aux glycoprotéines, ce qui laisse supposer que le bout du cil peut adhérer à la couche de mucus pour aider à sa propulsion (Fisch and Dupuis-Williams 2011). Plus de 20 protéines différentes, spécifiques de l’extrémité du cil et qui interviennent dans ses fonctions de régulation et signalisation, sont ainsi recensées (Croft et al. 2018).

Figure 38 : Réseau de cytosquelette sous la surface des cellules ciliées entre la base des cils. A) Image en coupe transversale d’une cellule ciliée de la trachée de souris en microscopie électronique à transmission (TEM) et en fluorescence et microscopie électronique à très haut voltage (UHVMET). En vert les structures de microtubules (« MT ») avec leurs points de jonctions que sont les pieds basaux en rouge (« BF ») et en jaune les filament intermédiaires (« IMF »). B) et C) Schémas en vue de profil de la structure du réseau de cytosquelette. Les images sont issues de l’article de Tateishi et al., 2017.

II.1.1.2. Mécanismes de régulation

Le cil ou la flagelle sont des objets biologiques et leurs mouvements, que ce soit en termes de flexibilité et forme du battement mais aussi de phase, d’amplitude et de fréquence du cycle, peuvent évoluer (Figure 39) afin de s’adapter à leur environnement (Ma et al. 2014; D. Eshel, Grossman, and

A B

149

Priel 1985; Sartori et al. 2016; L. Liu et al. 2014). Pour cela, les cils possèdent des capacités sensorielles, principalement localisées à l’extrémité du cil, afin de sonder l’environnement extérieur. Des capacités de transport intra-ciliaire et de communication inter-cellules, qui vont être succinctement développé ci-dessous, permettent de réguler en continue le battement du cil en fonction des signaux perçus.

Figure 39 : Evolution de la forme et du signal du battement ciliaire. A) Schéma de la régulation intra-ciliaire de la courbure et de la forme du flagelle, ou du cil, par la contraction des bras de dynéines (segments bleus et verts). Schéma d’après Sartori et al., 2016. B) Fluctuations du signal optique d’un cil, notamment de son amplitude et sa fréquence de battement. Figure d’après Eshel, Grossman and Priel, 1985. C) Evolution de la phase φ de battement d’un flagelle. La fonction de corrélation de phase C(t) = exp{i[φ(t0+t)- φ(t0)]} est représentée au cours du temps et le coefficient de diffusion de phase D est exprimé par la courbe rouge. Figure d’après Ma et al., 2014.

Le transport intra-ciliaire (IFT en anglais) est réalisé grâce à des chargements de signaux et molécules le long des structures de microtubule par des protéines motrices de l’extrémité du cil à la zone de transition et la base du cil (Chien et al. 2017; Ou et al. 2005). La communication inter-cellules se fait notamment par l’intermédiaire de vésicules, relâchés par les cils et microvilli à partir de leur membrane plasmique, pouvant voyager de cil à cil ou directement vers la membrane d’une autre

A

150

cellule (Wood and Rosenbaum 2015; J. Wang and Barr 2018). En plus des paramètres de battement, ces mécanismes permettent également de réguler la longueur des cils ou flagelles lors de leur croissance (Uddin et al. 2019; Marshall and Rosenbaum 2001) et le nombre de cil par cellule dans le cas des cellules multi-ciliées, qui est ajusté en fonction de la surface de la cellule sur l’épithélium (Nanjundappa et al. 2019).

Figure 40 : Schéma des mécanismes de transport intra-ciliaire (IFT) et communication intercellulaire par l’émission de vésicules (EV). « TZ » : zone de transition du cil (cf Figure 37), « PM » : membrane plasmique du cil et « MT » : microtubules. Figure d’après Wang et Barr, 2018.

Cette régulation et adaptation du battement du cil à son environnement est particulièrement visible sur sa fréquence (Figure 41), avec une forte dépendance à la viscosité extérieur (Humphries 2013; L. Liu et al. 2014) et l’épaisseur de la couche péri-ciliaire (L. Liu et al. 2014) mais aussi la température (Humphries 2013; D. Eshel, Grossman, and Priel 1985), le pH (Clary-Meinesz et al. 1998) et l’intensité lumineuse (Drescher, Goldstein, and Tuval 2010). Elle s’opère notamment par la régulation de la concentration en calcium intracellulaire (L. Liu et al. 2014).

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Figure 41 : Evolution de la fréquence du battement ciliaire en fonction des propriétés de son environnement. A) et B) Variation de la fréquence de battement des cils du bivalve Mytilus Eludis en fonction A) de la viscosité et B) de la température du milieu. Les lignes solides et pointillées représentent des modèles. Figures d’après Humphries, 2013. C) Fréquence de battement des cellules ciliées bronchique humaines (prélèvements de poumons) en fonction du pH après 5 min d’incubation (ajout de HCl ou de NaOH à du milieu nutritif). Figure d’après Clary-Meinesz et al., 1998. D) Fréquence de battement ωs de la paire de flagelle de l’algue coloniale Volvox Carteri en fonction de l’intensité lumineuse I. La ligne rouge représente un modèle. Figure d’après Drescher, Goldstein and Tuval, 2010.