Biologie cellulaire 142

1) Lignées cellulaires

Les cellules THP-1 DualTM (InvivoGen) dérivent des cellules monocytaires humaines THP-1, elles sont transfectées de manière stable par deux plasmides intégratifs : l’un portant le gène codant pour une phosphatase alcaline sécrétée sous le contrôle d’un promoteur inductible par NF-κB et AP-1 et l’autre portant le gène codant pour une luciférase sécrétée sous le contrôle du promoteur inductible par ISG54 (régulation de la voie de l’interféron).

Les cellules HEK-BlueTM hTLR2 et hTLR4 dérivent des cellules épithéliales humaines HEK. Elles surexpriment les récepteurs humains TLR2 et TLR4 et sont transfectées de manière stable par le plasmide portant le gène codant pour une phosphatase alcaline sécrétée sous le contrôle d’un promoteur inductible par NF-κB et AP-1.

Les cellules THP-1 sont cultivées en milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI), L- glutamine (11875093, ThermoFisher Scientific) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF, 10091148, ThermoFisher Scientific) et 50 µg/ml de Pénicilline Streptomycine (15070063, ThermoFisher Scientific) à 37°C sous atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Les cellules HEK-BlueTM hTLR2 et hTLR4 sont cultivées dans les mêmes conditions dans du milieu Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), 4,5 g/L Glucose, L-glutamine (11965-092, ThermoFisher Scientific) supplémenté par 10 % de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine.

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2) Cellules dendritiques murines dérivées de moelle osseuse (BMDC)

Les cellules de moelle osseuse sont extraites des tibias et fémurs de souris C57Bl/6 (Janvier) avec 5 mL de milieu Iscove Modified Dulbecco’s Medium (IMDM), L-glutamine, HEPES (GE Healthcare, SH30228). La suspension cellulaire est centrifugée 10 min à 300g à 4°C et remise en suspension dans le même milieu avec 10 % de SVF, pénicilline-streptomycine (50 µg/ml) et cultivées pendant 4 h en boîtes de Pétri afin d’éliminer les cellules différenciées. Pour obtenir les BMDCs, les cellules non-adhérentes sont cultivées à une densité de cellules de 106 cellules/ml dans du milieu IMDM, 10 % de SVF, 50 µg/ml de pénicilline-streptomycine, 50 µM de 2-β-mercaptoéthanol et 10 % de milieu conditionné de surnageant de culture de cellules J558 comme source de GM-CSF. Le troisième jour, du milieu frais contenant du GM-CSF est ajouté et le sixième jour, la moitié du milieu est renouvelée. Les BMDC sont collectées le huitième jour et utilisées sans pré-activation.

3) Cellules dendritiques dérivées de monocytes

Le sang issu de donneurs sains est obtenu auprès de l’établissement français du sang dans le cadre d’une convention. Les PBMC sont isolées sur gradient de Ficoll, l’ensemble des étapes conduisant à leur purification est réalisé à température ambiante. Le sang est dilué au demi puis déposé doucement sur un milieu de séparation des lymphocytes (MSL, Eurobio) pour éviter qu’ils ne se mélangent l’un à l’autre (MSL, Eurobio). Après 30 min de centrifugation à 600g, l’anneau lymphocytaire est récupéré. Les PBMC sont lavées trois fois avec du PBS, les centrifugations sont réalisées à 900g afin d’éliminer les plaquettes. Les cellules sont ensuite réparties dans une plaque 24 puits à 5.106 cellules/ml/puits dans du milieu RPMI 1 % SVF, 50 µM de 2-β-mercaptoéthanol et 50 µg/ml de pénicilline-streptomycine. Les monocytes sont séparés par adhérence pendant 2 h. Les cellules non-adhérentes sont aspirées avec le surnageant. Les monocytes sont lavés délicatement avec du PBS Ca2+/Mg2+ (Gibco, ThermoFisher Scentific) à 37°C. 1 ml de milieu RPMI, 1 % SVF, 50 µM de 2-β-mercaptoéthanol et 50 µg/ml de pénicilline-streptomycine, IL-4 (1000 UI/ml) et GM-CSF (4000 UI/ml) est ajouté dans chaque puits. Les cellules sont cultivées dans ce milieu à 37°C sous atmosphère humide avec 5 % de CO2. Le 3ème jour 1 ml de milieu RPMI 1 % SVF, 50 µM de 2-β-mercaptoéthanol et 50 µg/ml de pénicilline-streptomycine, IL-4 (1000 UI/ml) et GM-CSF (4000 UI/ml) est ajouté. Après 3 jours, soit 6 jours de différenciation, les cellules dendritiques non-adhérentes sont collectées et utilisées sans pré-activation.

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4) Evaluation de la réponse inflammatoire

a) Infection, stimulation et traitement

Les cellules THP-1 sont distribuées dans une plaque 96 puits à 100 000 cellules/puits dans du milieu RPMI, les cellules HEK sont diluées à 50 000 cellules/puits dans du milieu DMEM et les cellules dendritiques à 150 000 cellules/puits dans du DMEM également.

- Traitements

Le M3T est dilué dans du PBS puis ajouté dans les puits pour obtenir une concentration finale de 5, 10 ou 25 µg/ml dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée pendant 1 h à 37 °C. Les cellules sont ensuite infectées ou stimulées avec un ligand purifié (LPS, Pam3CSK4, zymosan (InvivoGen), lipoprotéines de F. novicida).

Lorsque les cellules sont traitées avec un anticorps (anti-TLR1, TLR-2, TLR6 (InvivoGen), DC- SIGN (Beckman)), celui-ci est ajouté 30 min avant le M3T ou avant la stimulation aux concentrations indiquées sur les figures.

- Infection par F. novicida

10 µL de suspension bactérienne de F. novicida, diluée dans du PBS sont ajoutés dans chaque puits à la MOI choisie (concentration déduite de l’absorbance à 600 nm). La plaque est ensuite centrifugée à 400 g pendant 10 min puis placée à 37 °C pendant 18 h. Afin de déterminer la MOI réelle, l’inoculum est dilué (dilutions successives d’un facteur 10), et les différentes dilutions sont étalées sur milieu gélosé TSA 0,1 % de cystéine. Les boites de Pétri sont incubées à 37°C pendant 24 h et les colonies sont ensuite dénombrées afin de déterminer la concentration de l’inoculum.

- Stimulation

Les ligands sont dilués dans du PBS puis ajoutés dans les puits à la concentration choisie. Les cellules sont ensuite incubées pendant 18 h.

b) Mesure de l’activation de NF-κB et dosage de cytokines

Après l’infection ou la stimulation par un ligand purifié, le surnageant est collecté puis filtré avec un filtre 0,2 µm. L’activation de NF-κB et la concentration en l’IL-8 est mesurée dans le surnageant des cellules THP-1, et le TNF-α et l’IL-6 sont dosées dans le surnageant des cellules dendritiques. Les cytokines sont dosées par la méthode ELISA à l’aide des kits ELISA Ready- SET-Go!, eBioscience, selon le protocole du fournisseur. La mesure de l’activation de NF-κB se fait par l’ajout de 180 µL de Quantiblue (InvivoGen) sur 20 µL de surnageant de culture. L’absorbance à 630 nm est mesurée après 1 à 4 h d’incubation.

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c) Mesure de l’expression des marqueurs d’activation par cytométrie en flux

Après prélèvement du surnageant, les cellules sont lavées avec une solution de PBS à 3 % de SVF, puis transférées dans une plaque 96 puits à fond rond. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C avec un anticorps anti-CD40, anti-MHCII ou anti-CD80 couplé avec un fluorochrome (APC, PE, FITC) (eBioscience) aux concentrations indiquées par le fabricant. Les cellules sont lavées puis fixées pendant 2 h avec du PBS contenant 4 % de PFA. L’intensité de fluorescence est ensuite analysée par cytométrie en flux ( FACSCalibur, BD Biosciences)

5) Mesure de la croissance intracellulaire de F. novicida

La croissance intracellulaire a été évaluée dans les cellules THP-1. Les cellules sont rendues adhérentes par l’ajout de 20 ng/ml de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma), dans le milieu de culture (RPMI, SVF, Péniciline-Streptomycine) pendant 48 h. Les cellules sont lavées pour éliminer le PMA, puis infectées par F. novicida avec la méthode décrite dans le paragraphe 4-a) pendant 1 h seulement, puis lavées 3 fois avec du PBS. Le milieu de culture est alors remplacé par du RPMI contenant 10 µg/ml de gentamicine afin d’éliminer les bactéries extracellulaires. A différent temps post-infection, le surnageant est aspiré, les cellules sont lavées avec du PBS puis lysées avec du PBS contenant 1 % de saponine. Le lysat est ensuite dilué (dilutions successives d’un facteur 10), et les différentes dilutions sont étalées sur milieu gélose TSA 0,1 % de cystéine. Les boites de Pétri sont incubées à 37°C pendant 24 h et les colonies sont ensuite dénombrées.

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II- Expérimentation animale

Les animaux sont hébergés dans des isocages sur portoirs ventilés dans l’ASB3. La nourriture et l’eau sont accessibles en continu.