Les biocapteurs à glucose de deuxième génération, la médiation artificielle

2.3.1. Principe

Ce type de biocapteur se propose de s’affranchir de la contribution de l’O2 dans la mesure du glucose par l’emploi de médiateurs artificiels. Ces derniers sont des molécules rédox qui font office de collecteurs d’électrons de la GOx en lieu et place de l’O2. Les électrons sont ensuite transmis à l’électrode par réoxydation du médiateur qui est alors à nouveau disponible pour réagir avec l’enzyme. Un des intérêts de ce type de biocapteur est que sa non-dépendance à l’O2 permet l’utilisation d’autres enzymes que la GOx, oxydant le glucose mais non réactives à l’O2 (cf. § 1.). Selon l’espèce chimique utilisée comme médiateur, ce dernier peut capter un ou deux électrons à l’enzyme.

Glucose

Gluconolactone

Enz

Enz

Med

Med

Courant

Parcours de l’électron (potentiels croissants)

Signal électrique Reconnaissance moléculaire

et oxydation catalytique Médiation rédox

E le ctr od e

e

-I

Schéma 1. Du glucose au courant électrique : le parcours de l’électron dans un biocapteur de deuxième génération. Une paire de flèches accolées représente une réaction rédox Les flèches noires et grises correspondent respectivement à des oxydations et à des réductions. Enz : enzyme ; Med : médiateur rédox ; Ox : état oxydé ; Red : état réduit.

Le principe du biocapteur à glucose de deuxième génération est présenté sur le Schéma 1. Ce dernier met en relief le parcours des électrons, qui passent par trois espèces réduites de couples rédox différents avant d’être collectés à l’électrode. Pour assurer ce transfert, la thermodynamique impose un gradient positif de potentiel rédox entre chaque couple mis en jeu. Un moyen simplifié mais particulièrement pratique pour connaître la possibilité du transfert électronique est de comparer les potentiels standards apparents (E°’) des différents couples rédox, tels que :

) E

( '

E '

E '

E

d Re Ox d

Re

Ox

≤ ° ≤

°

≤

°

Naturellement, il convient de rester prudent, en particulier en ce qui concerne les transferts d’électrons mettant en jeu les enzymes, bien plus complexes qu’une réaction rédox ordinaire.

2.3.2. Caractéristiques du médiateur idéal

Pour transmettre efficacement les électrons du glucose jusqu’à l’électrode et obtenir de bonnes propriétés pour le biocapteur (linéarité, sensibilité, sélectivité, etc.), l’étape de médiation est cruciale. Elle est à l’évidence largement dépendante de la nature du médiateur choisi. Idéalement, celui-ci doit présenter plusieurs caractéristiques [25, 26, 41, 42, 44]^* :

• une bonne stabilité chimique dans son état réduit et oxydé ;

• il ne devrait pas être toxique (en particulier pour des applications in vivo !) ;

• sa forme oxydée doit réagir rapidement avec la forme réduite de l’enzyme. Ceci permet d’une part d’augmenter la sensibilité du capteur, mais aussi d’éviter ou d’atténuer une possible compétition de l’O2 pour les électrons de l’enzyme si la GOx est utilisée^**. Notons que la valeur du E°’ du médiateur n’est pas anodine dans la mesure où elle définit sa différence de potentiel avec le centre rédox de l’enzyme et donc sa force motrice pour capter ses électrons ;

• le E°’ du médiateur doit être suffisamment faible pour réaliser son oxydation à un potentiel d’électrode minime et ainsi éviter l’oxydation des espèces interférentes telles

* Remarquons que la majorité de ces considérations seront toujours valables pour des bioanodes à médiateur rédox dans des applications en biopiles. D’ailleurs, un article de revue sur les biopiles met en avant les mêmes propriétés, à l’exception notable d’éventuelles interférences de l’O2 sur la bioanode [45].

** Cette compétition entre l’O2 et le médiateur rédox sera plus largement décrite dans le chapitre 3 du présent manuscrit.

l’urate ou l’ascorbate. Remarquons que cette considération est à mettre en balance avec la précédente, qui requiert entre autre un E°’ plutôt élevé ;

• l’oxydation hétérogène doit être rapide et se produire à de faibles surtensions d’électrode ;

• le E°’ du médiateur devrait être indépendant de la valeur du pH.

• certains auteurs rappellent à juste titre que la forme réduite du médiateur ne devrait pas réagir avec l’O2 [41, 42, 44].

• un faible coût associé à une forte disponibilité offrirait un avantage certain.

D’autres caractéristiques peuvent être à prendre en considération^* selon le type de médiation à pourvoir, en particulier si le médiateur est utilisé dissous en solution ou immobilisé sur la surface de l’électrode.

2.3.3. Médiateur en solution

Les premières recherches sur les biocapteurs de deuxième génération ont porté sur la médiation en solution, dont le principe est résumé dans le Schéma 2. Dans ce cas, le médiateur doit aussi être soluble et présenter de bonnes propriétés diffusionnelles [26].

Schéma 2. Principe de la médiation en solution. Tiré de [46], adapté pour le cas de l’oxydation du glucose.

* Les droits de propriété intellectuelle à propos d’un médiateur rédox (ou d’un biocapteur dans son ensemble) ne seront pas abordés dans ce manuscrit, dont l’objectif est scrupuleusement scientifique. Si des biocapteurs de quelques laboratoires pharmaceutiques seront cités à titre d’exemples, l’auteur se défend de tout conflit d’intérêt.

glucose enzyme gluconolactone

Pour les biocapteurs commerciaux utilisant des bandelettes réactives à usage unique, la médiation est généralement de ce type. L’électrode de travail est recouverte d’un mélange d’enzyme, de médiateur rédox et d’autres adjuvants. Quand le sang atteint l’électrode, le mélange est dissous et la réaction a lieu en solution. Le Tableau 1 présente quelques couples enzyme/médiateur des mélanges déposés sur les bandelettes réactives commerciales. La diversité des composés met en relief la constante évolution dans la recherche pour de nouveaux biocapteurs et le fait que chaque couple présente nécessairement avantages et inconvénients.

Fabricant Enzyme Médiateur

Abbott Diabetes Care

(FreeStyle) PQQ-GDH Complexe d’osmium

Roche

(Accucheck Aviva) PQQ-GDH Non disponible

Arkray

(Arkray) PQQ-GDH Hexaamine de

ruthénium Bayer Health Care

(Ascencia Countour +) FAD-GDH Ferricyanure Medisense

(Precision Xtra) NAD-GDH Phénanthroline quinone BD Diagnostic

(BD Test Strip) GOx Ferricyanure

Home Diagnostic, Inc

(True Track Smart System) GOx Ferricyanure Prévue d’être remplacée par la FAD-GDH fin 2010 [23]

Tableau 1. Enzymes et médiateurs utilisés dans les bandelettes réactives jetables de quelques compagnies majeures dans le marché des biocapteurs à glucose (liste non exhaustive).

Les médiateurs présentés dans le tableau sont assez représentatifs de ceux généralement utilisés. On peut notamment distinguer le ferricyanure, les complexes d’osmium ou de ruthénium, la phénothiazine et de nombreux dérivés du ferrocène ou des quinones ainsi que des colorants organiques (bleu ou vert de méthylène, bleu de Würster). Bien sûr, de nombreux autres médiateurs peuvent être employés^*.

* Un article de revue fort bien documenté a les moyen de satisfaire tout éventuel curieux [6]. En plus d’une pléthore de médiateurs rédox, la revue recense de nombreuses oxydoréductases avec leur E°’.

Outre le fait que ce type de médiation ne permet qu’une seule mesure, la contamination de l’échantillon proscrit un usage in vivo. Notons cependant que le caractère homogène de la réaction rédox en solution est encore largement utilisé pour établir des modèles théoriques ou obtenir des valeurs cinétiques précises, ce qui est largement plus complexe quand l’enzyme et le médiateur sont confinés sur l’électrode. Remarquons encore que de nombreuses méthodes innovantes d’immobilisation d’enzymes sur des électrodes sont aussi évaluées à l’aide de médiateurs en solution. Elles ne seront pas traitées dans ce manuscrit.

Dans le but d’éviter les contaminations dues au relargage d’espèces et de pouvoir effectuer plusieurs mesures avec le même capteur, l’enzyme et son médiateur ont ensuite été immobilisés sur la surface de l’électrode.

2.3.4. Médiateur et enzyme immobilisés

Une proportion importante des recherches s’est alors focalisée sur des électrodes sur lesquelles sont immobilisés à la fois l’enzyme et le médiateur rédox. De nombreuses techniques ont été proposées et ne seront pas détaillées [42, 47]. Une méthode simple est la coadsorption des deux espèces sur la surface de l’électrode [48]. Il est aussi possible d’immobiliser l’enzyme et le médiateur sur l’électrode à l’aide de pâte de carbone [49-51].

Dans ces conditions, si les espèces électroactives ne sont pas maintenues stériquement ou par des liaisons chimiques fortes sur l’électrode, alors il est envisageable d’être confronté à leur rejet dans la solution, en particulier lors de variations dans le milieu environnant (T, pH, force ionique, convection) [52]. Il s’en suit alors une dégradation de la réponse du biocapteur et la contamination de l’échantillon. Ajouter une membrane sur l’électrode peut permettre d’empêcher cette expulsion [53, 54]. La membrane peut être électropolymérisée par-dessus l’enzyme et le médiateur adsorbés. Une électropolymérisation in situ de pyrrole dans un mélange de pâte de carbone et de GOx a permis une excellente rétention de l’enzyme sur l’électrode modifiée [55]. La membrane ne doit pas pour autant empêcher la diffusion du glucose vers l’électrode ni l’évacuation de son produit de réaction^*.

* Toutefois, l’ajout d’une membrane est souvent mis à profit pour ralentir la diffusion du glucose et ainsi accroître le domaine de linéarité du capteur (au détriment de sa sensibilité). Elle peut aussi permettre l’exclusion stérique de certains interférents [26].

Modifier les enzymes pour assurer leur immobilisation est une technique qui, quoique plus complexe, présente des résultats tout à fait intéressants qui peuvent permettre de mieux appréhender les phénomènes de transferts électroniques depuis le biocatalyseur. Une technique élégante a été de reconstituer la GOx à partir de son apoenzyme (enzyme dépourvue de son cofacteur) sur des centres FAD, eux même greffés sur un médiateur (PQQ) attaché à une électrode d’or [56]. Son principe est présenté sur le Schéma 3.

Schéma 3. Reconstitution de la GOx sur une électrode d’or modifiée. Sur une monocouche cystéamine-PQQ-FAD, l’apo-GOx vient se greffer sur son FAD manquant. Suite à l’oxydation de glucose le transfert d’électron est médié par la PQQ.

Tiré de [57].

Pour immobiliser efficacement l’enzyme et le médiateur sur la surface de l’électrode, l’utilisation de polymères hydrophiles sur lesquels des médiateurs rédox ont été préalablement greffés a donné lieu à de nombreuses études depuis une vingtaine d’années [58]. Les médiateurs ainsi fixés peuvent, par auto-échanges d’électrons, « connecter électriquement » l’enzyme à l’électrode (voir Schéma 4).

Ce type de méthode est réputé pour l’obtention de fortes densités de courant (donc de bonnes sensibilités) ainsi que pour une bonne protection contre la compétition de l’O2 pour les électrons de la GOx si c’est cette dernière qui est utilisée [26, 59]. On dénote ainsi plusieurs techniques d’immobilisation de l’enzyme. L’enzyme peut être immobilisée par l’électropolymérisation de monomères (typiquement du pyrrole) dont une fraction est liée à un médiateur rédox [60, 61].

Schéma 4. Médiation électronique sur une électrode modifiée. Cas d’une enzyme immobilisée dans un hydrogel rédox. L’électron va de l’enzyme à l’électrode par auto-échanges électroniques entre les médiateurs rédox. Tiré de [46], adapté pour le cas de l’oxydation du glucose.

Des adsorptions successives de monocouches de GOx et de polymère rédox à base d’osmium sur des électrodes d’or fonctionnalisées ont aussi présenté d’intéressants résultats.

Le parfait contrôle du nombre de couches immobilisées, entre autre, a permis d’élégantes analogies avec des modèles théoriques [62, 63]. Enfin, un mélange d’enzyme et de polymère rédox peut être déposé sur la surface de l’électrode et chimiquement lié par un agent réticulant [64, 65]. C’est cette dernière méthode qui sera mise à profit tout au long de cette thèse. Etant donnée l’importance majeure de l’hydrogel rédox dans les deux études proposées dans ce manuscrit, une partie lui sera intégralement dédiée à la fin du présent chapitre.