Billes d’alginate de calcium

Une deuxième adaptation est alors testée : des billes d’alginate de calcium préparées à partir d’une solution d’alginate contenant le milieu de culture DF sans fer et/ou les bactéries ou de l’illite dopée sont polymérisées dans une solution de CaCl2 (Figure 20 et Figure 23 A, B). Ce système permettrait d’éviter tout contact et échange ionique entre l’illite dopée en Cs et le milieu de culture, tout en maintenant une croissance bactérienne et la production de PVD. Les billes d’alginate de calcium sont des supports utilisés généralement pour mimer l’immobilisation microbienne sous forme de biofilm. Ces techniques d’immobilisation permettent en effet de limiter les variations des conditions physico-chimiques et biologiques dans l’environnement immédiat des microorganismes et de favoriser l’adaptation de ces derniers à des stress environnementaux et ainsi d’améliorer la survie microbienne lorsque la technique de bioaugmentation est employée (van Elsas and Heijnen, 1990). L’alginate est un polysaccharide composé d’acide D-mannuronique et d’acide L-gluconique, obtenu à partir de différents types d’algues et produits également par certaines Pseudomonas lors de la formation de biofilms, ce qui en fait un support tout à fait adapté à ces bactéries (Cancela et al., 2003).

ETUDE DE LA MOBILITE DU CS DE L’ILLITE OU DU CS EN SOLUTION DANS LES BILLES D’ALGINATE DE CALCIUM

(FIGURE 20 ET FIGURE 23A)

Une première solution consiste à isoler du milieu de culture l’illite dopée en Cs dans les billes d’alginate de calcium, en formulant l’hypothèse que les bactéries pourraient croitre en suspension dans le milieu DF sans fer (Tableau 13) et que la PVD et les autres métabolites bactériens pourraient diffuser suffisamment au sein des billes d’alginate de calcium pour mobiliser le Cs de l’illite. L’illite dopée aux deux concentrations (10 et 100 mmol.kg-1) est ajoutée à la solution d’alginate de sodium (30 g.L-1) puis la suspension apportée est polymérisée au contact de la solution de CaCl2 (30 g.L-1). Des billes témoin, sans illite, et ne contenant que du Cs (CsCl) ajouté à la solution d’alginate de sodium avant polymérisation, sont également réalisées et ajoutées à une solution de NaCl afin d’étudier la diffusion du Cs à travers ses billes.

Quel que soit la forme sous laquelle se trouve le Cs (Cs mélangé à l’alginate de sodium ou Cs sorbé à l’illite), il ne diffuse pas au travers des billes d’alginate de calcium. Le Cs étant chargé positivement, il s’est très probablement sorbé sur les billes mimant le biofilm. Cette observation répond à l’hypothèse soulevée dans le paragraphe 2.1 quant à la sorption du Cs à l’intérieur du biofilm de l’illite. En effet, les groupements carboxyliques des polysaccharides de l’alginate sont chargés négativement dans un milieu neutre ou alcalin, ce qui est le cas dans notre étude (pH 7 ± 0.3). Ces groupements ont en effet une grande affinité pour les cations qui peuvent être fixés par échange d’ions

85 avec les protons des groupements carboxyliques (Arica et al., 2004; Ibáñez and Umetsu, 2004). Malheureusement, une fois le Cs éventuellement désorbé par les métabolites bactériens, il se resorbe sur les billes d’alginate de calcium ce qui empêche son dosage en solution.

MILIEU DE CROISSANCE DANS LES BILLES :ETUDE DE LA DIFFUSION DES CONSTITUANTS DU MILIEU DF SANS FER

A TRAVERS LES BILLES D’ALGINATE DE CALCIUM (FIGURE 20 ET FIGURE 23A)

Le contraire a alors été testé : l’illite a été mise en suspension dans la solution de NaCl à 1 mmol.L-1 alors que le milieu DF sans fer a été immobilisé dans les billes d’alginate de calcium.

Cette alternative consiste à isoler le milieu de croissance bactérien, et notamment le potassium et l’ammonium, dans des billes d’alginate de calcium afin de les séparer de l’illite dopée en Cs en suspension dans le milieu de culture liquide. Les billes d’alginate de calcium contenant les composés du milieu DF sans fer (le milieu DF sans fer additionné d’alginate de sodium à 30 g.L-1, le tout polymérisé au contact d’une solution de CaCl2 à 30 g.L-1) sont tout d’abord ajoutées à une solution de NaCl (1 mmol.L-1) sans illite, et le potassium (issu de sa désorption

K⁺ et NH₄⁺

compétiteurs du

Cs⁺

PVD ne diffuse pas à travers les billes

Croissance bactérienne dans les

billes (Figure 23 B 1)

Cs+ ne diffuse pas à

travers les billes DF sans fer

dans les billes (Figure 23 A)

K+ ne diffuse pas à

travers les billes

Illite à l’intérieur des billes (Figure 23 A)

Illite doit être à l’extérieur des billes Pas de croissance bactérienne hors des billes Bactéries doivent être à l’extérieur des billes (Figure 23 B 2) contraintes solutions conclusions

Figure 20 : Schéma récapitulatif des questions posées, solutions apportées et conclusions obtenues pour l’optimisation des conditions de culture de Pseudomonas fluorescens en vue de l’utiliser en présence d’illite dopée en Cs

éventuelle des billes) est dosé en solution après 48h d’agitation. Les analyses montrent une diffusion maximum de 8 % du potassium des billes d’alginate de calcium vers la solution. Cette quantité de potassium en solution est faible et sa rapide consommation par les bactéries pourrait suffire à éviter toute compétition avec le Cs de l’illite. La croissance des bactéries à l’intérieur et à l’extérieur des billes peut alors être testée.

ETUDE DE LA CROISSANCE DE P. FLUORESCENS IMMOBILISEES DANS LES BILLES D’ALGINATE DE CALCIUM OU CULTIVEES EN SUSPENSION EN PRESENCE DE BILLES D’ALGINATE DE CALCIUM ET DE SA PRODUCTION DE PYOVERDINE (FIGURE 23B)

L’illite dopée en Cs devant être dans le milieu environnant et isolé du milieu de croissance bactérien, les bactéries peuvent être à l’intérieur ou à l’extérieur des billes d’alginate de calcium. La croissance bactérienne et la production de PVD sont alors suivies au cours du temps suivant différentes modalités :

1) P. fluorescens est immobilisée en plus du milieu DF sans fer dans des billes d’alginate de calcium (correspondant à un volume d’environ 3ml). La concentration bactérienne est plus élevée que celle des cultures libres, de manière à obtenir dans le volume total de la culture, la même concentration bactérienne (Figure 23 B 1) ;

2) P. fluorescens est ajouté dans le milieu environnant en présence de billes contenant le milieu DF sans fer dans le but de faire croitre les bactéries à l’extérieur en admettant qu’elles forment un biofilm autour des billes et qu’elles mobilisent les nutriments contenu dans celles-ci (Figure 23 B 2) ;

1) Lorsque les bactéries sont immobilisées dans les billes d’alginate contenant le milieu DF sans fer, aucune croissance bactérienne n’est observée (Figure 20 et Figure 23 B 1). L’hypothèse avancée est que les concentrations en éléments chimiques du milieu de croissance n’étaient pas assez élevées pour la quantité de bactéries ajoutée. Le test a donc été renouvelé en augmentant les concentrations des composés du milieu DF sans fer (jusqu’à la limite de solubilisation de certains éléments dans l’eau et la limite de toxicité du glucose pour les bactéries). Avec un milieu DF sans fer concentré 5 fois, la croissance bactérienne est plus élevée que dans le milieu DF sans fer lorsque les bactéries sont en suspension (Figure 21). Cette plus forte croissance peut être due à la concentration en bactéries environ 10 fois plus élevée au départ ou encore à l’immobilisation. Plusieurs auteurs ont, en effet, montré l’effet positif de l’immobilisation bactérienne sur la croissance microbienne (Hall, 1998; van Elsas et al., 1992).

87 La production de PVD est quant à elle analysée dans la solution et dans les billes d’alginate de calcium après les avoir dissoutes. L’analyse montre une concentration très faible de PVD dans la solution comparée à celle mesurée dans les billes d’alginate de calcium et ce, indépendamment de la concentration du milieu de culture (Figure 22). La PVD ne diffuse donc pas à travers les billes d’alginate de calcium, contrairement aux métabolites neutres de faible poids moléculaire (Kierstan and Bucke, 1977; Zezza et al., 1993). Par exemple, P. fluorescens piégée dans des billes d’alginate de calcium à 30 g.L-1 libère dans le milieu des substances antibiotiques tels que des phloroglucinols (Russo et al., 1996). En revanche la PVD, qui fait partie des métabolites secondaires produits par

P. fluorescens, est une molécule complexe et chargée positivement (Figure 3) ; elle peut donc être retenue dans le

réseau de l’alginate comme le Cs+ ce qui corrobore les résultats obtenus par Julou et al.(2013) un biofilm de P.

aeriginosa.

L’illite dopée devant être à l’extérieur des billes et la PVD diffusant très peu à travers de celles-ci, cette adaptation ne permettrait donc pas d’observer l’effet des métabolites bactériens sur la mobilisation du Cs de l’illite.

0 2E+09 4E+09 6E+09 8E+09 1E+10 1,2E+10 0 10 20 30 40 50 60 C roi ss ance de P. fl uore sc ens ( U FC .m l-1) Temps (heure)

Culture de P. fluorescens immobilisée dans les billes Culture libre de P. fluorescens

Figure 21 : Croissance de P. fluorescens immobilisée dans des billes d’alginate contenant du milieu DF sans fer concentré 5 fois comparée à une culture libre dans du milieu DF sans fer

2) La deuxième alternative consiste à placer les bactéries à l’extérieur des billes d’alginate de calcium contenant le milieu DF sans fer ajouté à la solution d’alginate de sodium avant qu’il soit polymérisé au contact du CaCl2 (Figure 20 et Figure 23 B 2). L’hypothèse avancée est que les bactéries forment un biofilm autour des billes d’alginate de calcium et qu’elles mobilisent les nutriments nécessaires à leur croissance contenus dans celles-ci (comme à la surface d’une gélose nutritive sur boites de Pétri) puisque les nutriments comme le potassium diffusent peu à travers les billes. Cependant, aucune croissance bactérienne n’a été observée. Le test a donc été renouvelé en augmentant les concentrations des éléments du milieu de croissance comme précédemment mais à nouveau aucune croissance n’est observée. Les bactéries ne sont pas capables de prélever les nutriments nécessaires. Des billes d’alginate de calcium avec des pourcentages plus faibles d’alginate de sodium et de chlorure de calcium ont été réalisées afin de faciliter la mobilisation des éléments nutritifs mais aucun des tests n’a été probant.

Aucune des combinaisons utilisant des billes d’alginate de calcium n’est finalement adaptée. Les billes d’alginate de calcium ne peuvent donc pas être utilisées pour éviter le contact du Cs de l’illite et les composés du milieu de culture bactérien. 0 10 20 30 40 50 60 70

Diffusé Dans les billes

C oncent rat ion en PV D ( µ m ol .L

-1) DF sans fer x1 DF sans fer x2,5 DF sans fer x5

Figure 22 : Concentration en PVD produite par P. fluorescens immobilisée dans des billes d’alginate de calcium contenant du milieu DF sans fer concentré 1, 2,5 ou 5 fois

89 Figure 23 : Schéma décrivant les différentes étapes de tests réalisés pour l’optimisation des conditions de culture de Pseudomonas fluorescens en vue de l’utiliser