BARWON–DARLING RIVER SYSTEM 1. Catchment description

O diagnóstico precoce e correto da LTA é de fundamental importância para o estabelecimento de um tratamento efetivo, evita o desenvolvimento de uma doença crônica, por vezes com lesões desfigurantes (VAN DER MEIDE et al., 2005).

Diferentes técnicas são empregadas no diagnóstico da LTA, e muitas vezes, diferentes métodos são associados para se chegar ao diagnóstico final (CARVALHO, 2000), como: (1) observação clínica e epidemiológica; (2) detecção em material de biópsia, com pesquisa direta do parasito em esfregaços de pele, imprints, corados pelo método de May-Grunwald-Giemsa (Giemsa solução a 10%), (3) estudo histopatológico de secções de fragmentos de pele corados pela Hematoxilina-Eosina (H&E); (4) pesquisa indireta do parasito por meio de isolamento em cultura e inoculação em animais susceptíveis como o Mesocricetus auratus (hamster); (5) intradermorreação de Montenegro (IDRM); (6) Imunohistoquímica; (7) detecção do DNA do parasito pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SHIRIAN et al., 2014; VERNAL et al., 2016).

A sensibilidade de cada método diagnóstico pode variar de acordo com a experiência de cada serviço, a qualidade dos equipamentos e insumos utilizados, o tempo de evolução das lesões, as formas clínicas da LTA avaliadas e as diferentes espécies de Leishmania envolvidas na doença (BRASIL, 2010).

O diagnóstico clínico da LCL pode ser feito com base nas características da lesão associadas à anamnese, onde os dados epidemiológicos são de grande importância, especialmente se o paciente é proveniente de áreas endêmicas ou esteve presente em lugares onde há transmissão. A leishmaniose produz um amplo espectro de lesões, o que torna o diagnóstico clínico nem sempre simples ou imediato. Entretanto, a confirmação do diagnóstico pela observação do parasito é fundamental, tendo em vista o número de doenças que, clinicamente podem se assemelhar à LTA, tais como esporotricose, blastomicose, hanseníase, neoplasias (GOTO & LINDOSO, 2010). O diagnóstico de certeza da LTA requer a detecção do parasito em sítios de infecção, antes do início do tratamento (BRASIL, 2010; WHO, 2011). 1.5.1 Diagnóstico laboratorial da LTA

Os métodos diagnósticos que permitem a detecção direta do parasito são atualmente os métodos de escolha para diagnóstico de LTA por serem de mais fácil execução, resultado relativamente rápido e custo baixo. Dentre esses métodos estão o histopatológico, o esfregaço para imprint e a cultura em meio NNN (McNeil, Novy e Nicolle). A sensibilidade destes métodos, de uma maneira geral, decresce de acordo com o tempo de evolução da doença, lesões mais antigas apresentam menos parasitos. (FABER et al., 2003).

A biópsia da borda da lesão, um teste parasitológico, é realizada com punch de 2 ou de 3 mm em segmento livre de infecção secundária. O fragmento é fixado em formol tamponado

a 10%, processado e os cortes corados com giemsa e/ou hematoxilina-eosina e examinados ao microscópio. A chance de se encontrar o parasito é inversamente proporcional ao tempo de duração da lesão e a sensibilidade do método nos casos produzidos por L. braziliensis está em torno de 100% nos dois primeiros meses de evolução, 75% aos seis meses e 20% acima dos 12 meses (GONTIJO; CARVALHO, 2003).

O meio de cultura utilizado para diagnóstico de LTA é o NNN (ágar sangue modificado) e LIT (Liver Infusion Triptose), entre 24ºC e 26ºC. As amastigotas crescem relativamente bem nesses meios, obtendo-se uma sensibilidade em torno de 68.2%. Embora permita a determinação da espécie de Leishmania sp. envolvida, a cultura é um método dispendioso e muitas vezes prejudicado pela falta de cuidado na coleta, necessita ser realizada de maneira estéril, apresentando uma taxa de contaminação por fungos e bactérias da própria pele de 5,9% (CHOUIHI et al., 2009).

Outros métodos podem ser usados no diagnóstico de LTA de forma complementar, como a inoculação em animal experimental, a intradermorreação de Montenegro, testes sorológicos e moleculares. A inoculação em animal experimental é um método complexo e de alto custo, sendo mais aplicado a estudos sobre a evolução da doença e desenvolvimento da forma mucosa (MOURA et al., 2005).

A Intradermorreação de Montenegro (IDRM) expressa a reação de hipersensibilidade celular retardada (reação de hipersensibilidade tipo IV) ao antígeno da Leishmania sp. (NOGUEIRA et al., 2008). Resultados falsos positivos podem significar aplicação anterior de antígeno da própria IDRM, exposição ao parasito sem doença (comum em áreas endêmicas), alergia ao diluente do teste ou reação cruzada com outras doenças, como tuberculose (SOUZA et al., 1992). A IDRM persiste positiva indefinidamente, mesmo após a cura da lesão, não sendo um teste diagnóstico de escolha para diagnóstico de doença ativa, entretanto, funciona como indicador de sensibilização com Leishmania.

Os testes sorológicos detectam anticorpos anti-leishmania circulantes no soro dos pacientes, com títulos geralmente baixos. A técnica de ELISA (Ensaio Imuno Enzimático) apresenta uma sensibilidade de 84.6% e especificidade de 96.2% para diagnóstico da forma cutânea mucosa da LTA causada pela L. (V.) brasiliensis (GIL et al., 2011). Esse método ainda não está disponível comercialmente, tendo seu uso restrito à pesquisa.

A Imunofluorescência indireta (IFI) tem sensibilidade em torno de 78% e especificidade de 85% no diagnóstico de LTA causada pela L.(V.) braziliensis (DE OLIVEIRA et al., 2013). Alguns pacientes apresentam resposta persistentemente negativa, mas aqueles com lesões cutâneas múltiplas ou mucosas estão associados à presença de títulos

mais altos (DE OLIVEIRA et al., 2013). A IFI não deve ser utilizada como critério isolado para diagnóstico de LTA, pois apresenta muitos resultados falsos negativos e reações cruzadas (DE OLIVEIRA et al., 2013).

As técnicas de imunohistoquímica (IHQ), para detecção de amastigotas, foram previamente descritas em cães (LIVNI et al., 1983; FERRER et al., 1988; BOURDOISEAU et al., 1997; TAFURI et al., 2004) e no homem (LIVNI et al., 1983; BARBOSA et al. 1988; SALINAS et al., 1989; KENNER et al., 1999; QUINTELLA et al., 2009). Suautilização tem obtido sucesso no diagnóstico de LTA (WEIGLE et al., 1987; SALINAS et al., 1989; KENNER et al., 1999; SCHUBACH et al., 2001; QUINTELLA et al., 2009). A detecção de amastigotas de Leishmania, em cortes fixados por formalina tamponada e incluídos em parafina, tanto de tecidos humanos como em cães, tornou-se rotina, pela sua simplicidade, por não necessitar de equipamentos especiais, e ser altamente sensível e específico (LIVNI et al., 1983; FERRER et al., 1988; BOURDOISEAU et al., 1997; TAFURI et al., 2004). A introdução da Imunohistoquímica trouxe grande avanço na histopatologia, o que motiva seu uso cada vez mais frequente, para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias (PEREIRA et al., 2008).

Por fim, o PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) é um método que vem sendo utilizado para fins de pesquisa, acrescentando muito a sensibilidade quando associada aos métodos parasitológicos tradicionais, apresentando sensibilidade de 98,41% e especificidade de 95,59% no diagnóstico da LTA (SATOM et al., 2013). Esse método está indicado na investigação dos pacientes suspeitos de LTA com testes parasitológicos convencionais negativos. Vale ressaltar que, em áreas endêmicas, esta técnica precisa ser utilizada com cautela, pois muitos pacientes podem ter DNA do parasito sem doença, mas sim, por infecção prévia.