Para confirmar a hipótese de que as condições de mistura foram iguais em todos os 12 experimentos realizados, tomou-se 5 valores de gradiente de velocidade ao longo do tempo de mistura rápida nos instantes: 10, 20, 30, 40, 50 e 60 s. De forma similar, na mistura lenta foram anotados 12 pontos nos instantes de 2 a 15 min, contados a partir do início da mistura rápida.
De posse desses valores de gradiente de velocidade e com a finalidade de comprovar ou não a hipótese de igualdade, realizou-se comparações múltiplas através do teste bicaudal não paramétrico da soma de postos de Wilcoxon para amostras independentes. Cada teste foi ajustado pelo método de Bonferroni. Ao nível de significância de 5%, a hipótese de igualdade das condições de mistura nos experimentos foi aceita quando P > 0.05.
A integridade da membrana das células de D. circinale e dos tricomas de C. raciborskii foi avaliada por meio de um método de coloração celular utilizando a eritrosina B (Dinâmica Química Contemporânea). A eritrosina B (C20H6I4Na2O5) é um corante biológico que pode ser usado para distinguir células íntegras da danificadas (CALOMENI; RODGERS, 2015). Nos organismos com integridade celular preservada, a eritrosina B não adentra a célula, mantendo sua aparência natural mesmo na presença do corante. Já em células com a integridade comprometida, o corante penetra e se acumula no citoplasma produzindo uma cor rosa passível de ser observada por microscopia óptica (Markelova, Vladimirova e Kuptsova, 2000; Calomeni e Rodgers, 2015).
Imediatamente após cada CEi (Tabela 13) um volume de 1 ml das suspensões de C. raciborskii e D. circinale foi coletado e transferido para um tubo de ensaio e adicionado 1 ml de uma solução aquosa contendo 5 g de eritrosina B em 100 mL de água destilada. Após rápida homogeneização, a solução resultante foi abrigada da luz por 15 minutos, tempo de ação do corante e posteriormente preparou-se uma lâmina desta solução para exames utilizando microscopia óptica, conforme (MARKELOVA, A. G.; VLADIMIROVA; KUPTSOVA, 2000).
Para aumentar o poder dos testes estatísticos e garantir amostras grandes o suficiente para assumir distribuição qui-quadrado, foram avaliados aleatoriamente 100 organismos em triplicata. Portanto, para cada espécie, avaliou-se 900 organismos referentes a cada condição experimental (Tabela 2), tanto nos 4 SCi (Tabela 14) quando nos 12 experimentos na presença de pré-oxidação relacionados na Tabela 12, totalizando 14.400 resultados de integridade celular ao longo de todo o estudo.
A integridade celular foi considerada uma variável categóricas dicotômicas (organismos íntegros ou não). Devido as diferenças morfológicas entre C. raciborskii e D. circinale, para C. raciborskii considerou-se como não íntegro os tricomas corados pela eritrosina b (Figura 4A) e para D. circinale considerou-se com não íntegras as células coradas (Figura 4B).
De posse da média das triplicatas foram elaboradas tabelas de contingências (2 x 2), onde foram dispostos os valores de integridade nas colunas (organismos íntegros na coluna “Sim” e os organismos com estrutura comprometidas na coluna “Não”) e nas linhas, duas condições experimentais de um dado cenário de comparação. Essas tabelas foram utilizadas para testar hipóteses específicas. Foram considerados três cenários de comparação e suas respectivas hipóteses específicas (Tabela 15).
Tabela 15 – Cenários de comparação e suas respectivas hipóteses H1, H2 e H3 testadas
Hipóteses comparação Cenário de Descrição Condição para
Aceitação
H1
H1: π1 = π0 “a proporção* de organismos íntegros ou não após a mistura rápida (π1) e
igual a das condições iniciais (π2)”
CE1 x CE0
Verificar os efeitos da mistura rápida na integridade celular em
relação às condições iniciais, permitindo saber se as reduções
nas quantidades de organismos íntegros nesta etapa foram
significativas. P > 0.05 H2 H2: π2 = π0 “a proporção* de organismos íntegros ou não após a mistura rápida
seguida de lenta (π2) e igual a das condições
iniciais (π0)”
CE2 x CE0
verificar os efeitos da mistura lenta combinados aos da mistura rápida na integridade celular em relação às condições iniciais, evidenciando se as diferenças nas
quantidades de organismos íntegros foram significativa nessas etapas, não permitindo saber qual fase foi relevante, se apenas mistura rápida ou apenas
mistura lenta ou ambas.
H3
H2: π2 = π1 “a proporção* de organismos íntegros ou não
após a mistura lenta (π2) e igual após a mistura rápida
(π1)”
CE2 x CE1
verificar os efeitos apenas da mistura lenta em relação à mistura rápida, evidenciando se a
quantidade de organismos íntegros na após a mistura lenta é
significativamente diferente da mistura rápida. Fonte: Autor (2019)
Por meio das tabelas de contingência 2 x 2, as hipóteses de associação (H1, H2 e H3) entre integridade celular (efeito) e as condições experimentais da Tabela 13 na presença ou não dos oxidantes (causas) foram testadas. Como algumas células das tabelas de contingência obtidas tiveram frequências inferiores a 5, não foi possível realizar o teste Qui-quadrado de Pearson, optando-se então pela utilização do teste exato de Fisher para a comprovação da hipótese de associação ou independência entre as causas e o efeito (AGRESTI, 2012; BARNARD G.A., 1945; FISHER, 1934; GIOLO, 2017; MCNEMAR, 2002; OLEA- POPELKA; ROSEN, 2019; PAGANO; GAUVREAU, 2010; PLACKETT, 1983; YATES, 1934)
Dessa forma, ao nível de significância de 5%, foram evidenciadas associações significativas quando o teste exato de Fisher apresentou p < 0.05. Em seguida, calculou-se o nível de associação entre causa e efeito através da razão de chances ORCE (odds ratio) e da
razão de chances relativa, ORrel, definida de acordo com as Equação (16) e Equação (17),
respectivamente :
(16)
(17)
Em que P(CEi) e 1P(CEi) na Equação (16) representam, respectivamente, a proporção (ou probabilidade) de células íntegras e não íntegras observadas numa dada condição experimental i (i = 0, 1 ou 2) e ORCi representa na Equação (17) a razão de chance de um dada condição experimental inicial (CE1 ou CE0, dependendo do caso).
Para cada valor de ORCEi ou ORrel obtido, foi determinado um intervalo de
confiança IC(OR), utilizado a Equação (18):
(18)
Em que Ln(OD) é o logaritmo natural da OR e possui distribuição aproximadamente normal com médiaLn(OD) e variância assintótica V
Ln(OD)
e zα2 denota o 100(1-α/2) percentil da distribuição normal padrão. A estimativa de V
Ln(OD)
é dada por: (19) ) ( 1 ) ( i i CE CE P CE P OR i i i C CE rel OR OR OR
exp ( ) ( ) ) ( 2 OD Ln V z OD Ln OR IC α
2 1 , 1 )] ( [ j i nij ε OD Ln VEm que nijé o termo da célula da linha i e coluna j de uma tabela de contingencia 2 x 2 e ε é um termo de correção para casos em que o valor da célulanijé zero (PAGANO; GAUVREAU, 2010). Nesses casos, os dados foram transformados atribuindo-se ao termo de correção ε os valores de 0,5 (primeira transformação) e 1 (segunda transformação). Nos demais casos, ou seja,
0 ij
n considerou-seε0. O nível de confiança adotado foi de 95% [IC(95%)]. Assim, foi considerado que:
● ORrel > 1 e 1 ∉ IC(ORrel) : aumento da chance de células íntegras de um cenário em relação a outro;
● ORrel < 1 e 1 ∉ IC(ORrel): redução de chances de células íntegras de um cenário em relação a outro.
● ORrel = 1 ou 1 ∈ IC(ORrel): indicam que as chances são iguais entre os cenários comparados.
● Os valores dos testes exatos de Fisher, OR e intervalos de confiança com e sem transformações dos dados encontram-se no APÊNDICE A