B 1| Recherche et optimisation des structures initiales

Comme il a été abordé dans l’introduction de cette partie théorique, les structures initiales sont pré-requises pour pouvoir effectuer des simulations. Pour réaliser l’amarrage des peptides sur la protéine Fur dans les meilleures conditions possibles, il aurait fallu avoir les structures de ces molécules. A défaut de ces structures, il faut des modèles. Nous avons construit et optimisé des modèles avec les logiciels MODELLER et CHARMM. Les modèles sélectionnés ont constitué les coordonnées initiales pour l’amarrage moléculaire par AutoDock et les autres logiciels de « docking ». Le processus d’obtention de ces coordonnées initiales est développé ci-dessous.

III. B. 1. a| Structures initiales des aptamères peptidiques et des peptides

Les peptides de 13 acides aminés issus des aptamères peptidiques (confère tableau Tableau III.1, ci-dessous) n’ont aucune homologie avec des structures connues, d’après une recherche BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al. 1990). Des études de dichroïsme circulaire ont également montré que les peptides ne disposent d’aucune structure particulière. Les peptides ne sont pas assez longs pour pouvoir effectuer une recherche de structure secondaire sur les serveurs de prédiction. Des modèles ont donc été construits avec CHARMM et MODELLER en utilisant la méthode décrite ci-dessous.

La structure de la thiorédoxine A d’E. coli, résolue en 1990 à 1,68 Å (Code PDB : 2TRX) (Katti et al. 1990) (Figure III.9) a été utilisée comme plateforme pour construire les aptamères peptidiques (confère Introduction) de manière similaire aux travaux récents de

Brown et al (Brown et al. 2010). Ces derniers ont montré que l’insertion des peptides déstabilisait un peu la thiorédoxine de sorte que les peptides se trouvaient dans une conformation leur permettant d’interagir avec des protéines cibles.

Tableau III.1: Séquences des peptides issus des aptamères anti-EcFur

peptides Séquences pF1 RLWCRYPHPPLTD pF2 RQCNICGASLYSY pF3 ETCKCGSQVWRHS pF4 CARCGARVNVYKY pF5 (contrôle inactif) RSLRGRCLSQHQD

Figure III.9: Structure de la thiorédoxine A d'E. coli (2TRX) (Katti et al. 1990). Représentation en ruban où seules les chaînes latérales des résidus 32 à 34 sont montrées.

Cette structure comprend 4 feuillets β en jaune, 3 hélices α en rose une hélice D10 en violet, reliés entre eux par des boucles. Les résidus C32, G33, P34 et C35 du motif CXXC constituant du site actif de la thiorédoxine sont indiqués.

Pour mimer les aptamères peptidiques, les peptides de 13 acides aminés sont insérés dans le site actif entre la Pro34 et la Cys35 de la thiorédoxine (Brown et al. les ont insérés entre G33 et P34) (Brown et al. 2010). Deux résidus (Gly et Pro) sont ajoutés à l’extrémité Cter du peptide pour servir de « linker ». Les Cystéines 32 et 35 de la thiorédoxine sont

remplacées par des Sérines pour rester conforme à la séquence de l’aptamère utilisée dans les tests double-hybride antérieurs (Abed et al. 2007) (confère Figure III.10).

Figure III.10 : Modèle de construction d’un aptamère peptidique. Représentation en ruban où seules les chaînes latérales des résidus sérines remplaçant les cystéines sont montrées.

Pour construire la boucle constituée par le peptide, on utilise une fonctionnalité de MODELLER (Loop Modelling) qui permet de générer des modèles de boucles compatibles avec le reste de la protéine supposé fixe. Ainsi, dix modèles pour chaque aptamère sont construits dans MODELLER et classés suivant une fonction de pénalité (« objective function »). Afin d’obtenir une structure optimisée suivant le champ de force de MM habituellement utilisé dans ce travail, le modèle ayant la pénalité la plus petite est choisi puis optimisé dans CHARMM en figeant la chaine carbonée peptidique - appelée squelette ou « backbone » - de la thiorédoxine. Ainsi les chaines latérales de la thiorédoxine et le peptide+le linker sont flexibles pendant la simulation d’optimisation. Le peptide peut explorer l’espace conformationnel tout en étant fixé au niveau de ses extrémités à la thiorédoxine. Ces contraintes forcent le peptide à rester conforme à l’aptamère expérimental. L’ensemble est soumis à une dynamique moléculaire de 5 ns à 298 K dans un solvant implicite (méthode EEF1) qui génère 5000 « poses » ou « frames ». Les « frames » sont les enregistrements des coordonnées atomiques au cours du temps dans un processus de dynamique moléculaire qui produit une trajectoire. L’analyse de la trajectoire permet de choisir la conformation ayant l’énergie minimale après minimisation avec 100 de SD et 1000 pas d’ABNR.

Nous présenterons ci-dessous un modèle de l’aptamère F1 et l’extraction du peptide pF1 qui sera utilisé pour l’amarrage sur la protéine Fur (Figure III.11).

β1 β1 β1 β1 Nter Cter Rotation 180°

R1 L2 W3 C4 R5 Y6 P7 H8 P9 P10 L11 T12 D13 Glinker Plinker PThio GThio

Figure III.11: Modèle de l’aptamère F1 et extraction du peptide pF1. Représentation en ruban et zoom sur la partie du peptide inséré où les chaînes latérales des résidus sont montrées ainsi que les liaisons hydrogènes en hachurés et le nom des résidus.

Le peptide de 13 acides aminés est extrait de l’aptamère pour le « docking ». On constate que certains résidus du peptide peuvent former des liaisons hydrogènes avec la thiorédoxine ce qui participe à la formation d’une structure secondaire. En effet sur la Figure III.11, les résidus Gly et Pro forment des liaisons hydrogènes avec l’Arg5 et la Tyr6 du peptide pF1, formant un feuillet β. L’aptamère pourrait donc aider à la formation d’une conformation particulière du peptide permettant une meilleure interaction avec la protéine. Toutefois l’inactivation de la protéine Fur est due à la spécificité du peptide de 13 acides aminés, la partie active. Notons également que le peptide extrait est rendu flexible pendant le processus d’amarrage moléculaire sur la protéine. Nous verrons aussi que le peptide libre pF1 peut perdre et la retrouver sa structure secondaire dans l’approche de « docking » que nous utilisons.

Des simulations d’amarrage ont été réalisées avec les peptides pF1 à pF3 extraits des meilleures conformations des aptamères F1 à F3 obtenues avec MODELLER et CHARMM pour rechercher les meilleures zones d’amarrage sur la protéine EcFur.

Le squelette carboné de ces peptides ne bouge pas au cours des processus d’amarrage qui vont suivre. De plus, les tests expérimentaux ayant montré que les peptides libres de 13 acides aminés inhibent la protéine Fur, des conformations peptidiques libres (sans contraintes de l’aptamère) sont aussi construites pour l’amarrage sur la protéine. Ces derniers sont flexibles au niveau de la chaine carbonée pendant le processus d’arrimage. Nous disposons

ainsi de deux modèles (libres et contraints) de chaque peptide qui vont être amarrés sur la protéine afin de choisir le meilleur mode d’amarrage.

Ne disposant pas d’informations structurales concernant le domaine de dimérisation du monomère de Fur et sachant que le peptide pF4 interagit à ce niveau, nous avons décidé de ne pas poursuivre les simulations d’amarrage avec ce peptide.

III. B. 1. b| structures initiales de la protéine

La structure de la protéine EcFur qui nous intéresse n’étant pas entièrement connue, une modélisation par homologie avec MODELLER a été effectuée. Dans cette approche, le logiciel génère plusieurs modèles à l’image de la structure de protéines homologues. Pour choisir les homologues les plus proches d’EcFur, un alignement de séquences des protéines Fur a été réalisé (confère Figure III.12).

Figure III.12: Alignement des homologues de Fur de chez Escherichia coli (EcFur) : Yersinia pestis (YpFur), Vibrio cholerae (VcFur), Vibrio salmonicida (VsFur), Pseudomonas aeruginosa (PaFur), Helicobacter pylori (HpFur), Staphylococcus aureus (SaFur) et les « Fur-like »: Zur de chez Mycobacterium tuberculosis (MtZur), Nur de Streptomyces coelicolor (ScFur) et PerR de Bacillus subtilis (BsFur). Ces alignements ont été réalisés avec le programme CLUSTAL (Thompson et al. 1994).

Parmi ces séquences, sept structures cristallographiques de protéines Fur, y compris celle du domaine de liaison d’EcFur, sont actuellement connues :

• PaFur (Pohl et al. 2003)dans une conformation active (code PDB 1MZB)

• VcFur (Sheikh et al. 2009) dans une conformation active (code PDB 2W57)

• BsPerR dans la conformation inactive (forme Apo) (code PDB 2FE3) (Traore et al. 2006) et active (code PDB 3F8N) (Jacquamet et al. 2009)

• Le domaine de liaison d’EcFur (Pecqueur et al. 2006)(code PDB 2FU4)

• MtZur (Lucarelli et al. 2007)(code PDB 2O03)

• ScNur (An et al. 2009)(PDB code 3EYY)

• HpFur (Dian et al. 2011) (code PDB 2XIG)

Le tableau Tableau III.2 suivant résume les pourcentages de similarité entre les protéines EcFur, VsFur et FtFur et les homologues de structures connues : PaFur, VcFur, HpFur et BsPerR. Ce pourcentage a été calculé avec BLAST en divisant le nombre de « positifs » par la longueur de la séquence de la protéine cible à prédire.

Tableau III.2: Pourcentage de similarité des différentes protéines Fur

Modèle \ Cible EcFur VsFur FtFur

PaFur 77 (66) 78 (67) 64 (59) VcFur 91 (82) 93 (86) 64 (60) HpFur 51 (51) 53 (53) 60 (57) BsPerR 49 (49) 56 (49) 50 (48)

Les chiffres entre parenthèse représentent ce même pourcentage de similarité calculé à partir du nombre d’acides aminés effectivement présents dans la structure servant de modèle. Ce pourcentage est pris en compte pour choisir la structure à utiliser pour construire les modèles.

Parmi les structures connues actuellement, EcFur partage avec VcFur et PaFur la meilleure similarité, respectivement 91% et 77%. Au début de mes travaux, les structures de PaFur (1MZB) et de BsPerR (2FE3) ont été utilisées pour construire des modèles d’EcFur dans sa conformation inactive (Apo) et active (Holo). Par la suite, la structure de VcFur (2W57), qui partage la meilleure similarité avec EcFur, a été utilisée à la place de PaFur.

Les structures cristallographiques sont raffinées dans un premier temps, par minimisation de l’énergie, sous fortes contraintes avec CHARMM. Dans un second temps, ces structures optimisées sont utilisées comme « moule » pour construire les modèles d’EcFur avec MODELLER. La meilleure conformation parmi les dix conformations générées par le logiciel, est choisie sur la base de la fonction de score et raffinée avec CHARMM par une simple minimisation. La comparaison avec la structure cristallographique du domaine Nter d’EcFur disponible permet de valider le modèle choisi. Nous reviendrons sur cette partie dans la présentation du modèle d’EcFur construit à partir de la structure de VcFur.

Nous présentons ci-dessous les modèles d’EcFur construits à partir de PaFur (1MZB) et de BsPerR (2FE3), représentant respectivement la protéine dans sa forme inactive (Apo) et active (Holo).

La Figure III.13, ci-dessous montre la structure optimisée de la protéine BsPerR dans sa forme Apo. Cette structure a été raffinée dans CHARMM, par une minimisation (SD de 100 pas et ABNR 2000 pas) suivie d’une dynamique de 5 ns à 298 K dans un solvant implicite EEF1, en maintenant une contrainte harmonique sur le « backbone ». Ainsi les atomes de la protéine oscillent autour d’une position d’équilibre définie. Cela permet d’optimiser la structure de la protéine sans perdre la structuration initiale. Cette structure contient six hélices α et cinq feuillets β par monomère. Les brins β3−β5 et les hélices

α5−α6 s'unissent pour former le domaine de dimérisation, encadré en vert. Le domaine de liaison à l’ADN est formé des hélices α1−α4 et des brins β1 et β2 Cette structure a servi à construire le modèle d’EcFur dans sa configuration inactive.

Figure III.13: Structure optimisée de BsPerR dans sa configuration inactive (code PDB 2FE3)

La Figure III.14, ci-dessous présente le modèle d’EcFur construit par MODELLER (fonction de score = 1382) à partir de la structure optimisée de BsPerR ci-dessus (Figure III.13). Le modèle a été optimisé dans CHARMM en utilisant les mêmes paramètres de minimisation et de dynamique que la structure précédente de BsPerR. Comme on peut le voir sur la Figure III.14, ce modèle contient également six hélices α et cinq feuillets β par monomère. On peut noter la présence d’un petit brin β supplémentaire, visible au niveau du domaine de liaison à l’ADN et les boucles à l’extrémité Cter sur ce modèle.

Cette conformation représentera la forme inactive de la protéine EcFur utilisé pour les amarrages des peptides.

Domaine de dimérisation

Figure III.14: Modèle d'EcFur dans la forme inactive

Pour construire le modèle d’EcFur dans sa forme active, PaFur (1MZB) dont la structure optimisée est présenté ci-dessous (Figure III.15) a été utilisée dans un premier temps. Ce modèle sera noté EcFur_{1Pa par la suite. Plus tard la structure de VcFur a été} utilisée pour construire le modèle d’EcFur (EcFur_1Vc).

Figure III.15: Structure optimisée du dimère de PaFur (1MZB)

Cter Nter Domaine de dimérisation Domaine de liaison à l’ADN Nter Cter

La Figure III.16 ci-dessous montre le modèle d’EcFur dans sa forme active construit par MODELLER (fonction de score = 1341) à partir de la structure optimisée de PaFur ci- dessus. Ce modèle a été optimisé par la suite avec CHARMM avec les paramètres précédents.

Figure III.16: Modèle du dimère d'EcFur dans sa configuration active (réalisé par homologie avec PaFur)

Cette conformation est partiellement différente de celle de la structure de PaFur, pourtant utilisé pour sa construction. Ce modèle compte huit feuillets β contrairement à la structure de PaFur qui en contient six. En effet, le long feuillet β6 de PaFur ci-dessus a généré ici 3 brins β de taille plus courte (Figure III.16). Cette différence peut être liée à la grande différence des acides aminés entre EcFur et PaFur (voir Alignement de séquence Figure III.12).

Les deux modèles d’EcFur construits à partir de la structure de PaFur (1MZB) et de BsPerR (2FE3), respectivement sur la Figure III.16 et Figure III.14ont été utilisés pour l’amarrage des peptides anti-Fur. Nous verrons plus tard que c’est la structure de VcFur (2W57) qui a été utilisée ensuite pour construire le modèle EcFur dans sa forme active et sur lequel les simulations ont continué.