C 2| Amarrage des séquences de pF1 sur EcFur 1Vc

III. C. 2. a| Amarrage de pF1 entier : RLWCRYPHPPLTD

L’amarrage optimisé de pF1 sur le modèle EcFur1Pa nous donne les coordonnées initiales du peptide. Le complexe pF1-Fur est soumis au processus AADM, décrit précédemment avec une dynamique de 5 ns. Pour chaque « frame », l’énergie d’interaction entre le peptide et la protéine est évaluée par CHARMM. Les cinq conformations d’énergie minimale du complexe sont sélectionnées pour le « docking ». Plusieurs « dockings » en faisant varier les paramètres : nombre d’évaluations et taille de la population initiale, ont été effectués pour chaque « frame » sélectionnée afin d’obtenir une énergie libre favorable. La conformation ayant la meilleure énergie libre est présentée ci-dessous dans la Figure III.26

Figure III.26: Amarrage de pF1 sur EcFur1111Vc. Représentation en surface de la protéine, en jaune le

monomère A et en rouge le monomère B. Le peptide est représenté avec ses chaines latérales.

L’énergie libre de la liaison de ce complexe est de -18 kcal/mol avec une constante d’inhibition de 70 fM. Le peptide pF1 interagit ici aussi avec la conformation active de la protéine, comme l’a montré la spectroscopie du tryptophane (Vitale 2009). Le peptide est amarré entre les deux domaines Nter du dimère de Fur. Il interagit avec les domaines Nter et Cter du monomère ce qui est parfaitement en accord avec les résultats de double-hybride (Abed et al. 2007) (Vitale 2009). La valeur de l’énergie libre de liaison est légèrement plus faible que celle obtenue sur le modèle EcFur_{1Pa qui est de -20 kcal/mol. Cette petite} différence peut être due à la disposition des chaines latérales et/ou aux contraintes stériques exercées sur le peptide. Les principales interactions après l’amarrage sont montrées sur la Figure III.27.

Figure III.27: Vue d’ensemble des principales interactions entre pF1 et EcFur11Vc. Le peptide est 11

représenté en jaune avec ses chaines latérales en licorice (taille 3) et la protéine Chaine A et B, respectivement en vert et rouge, chaines latérales en licorice (taille 1) VMD (Humphrey et al. 1996).

Comme nous venons de la voir sur le modèle EcFur1Pa, le peptide pF1 interagit avec la protéine principalement via les résidus R1, W3, R5, Y6 et D13. Dans cet amarrage avec le modèle EcFur_{1Vc, pF1 interagit favorablement avec les résidus 1 à 6, 8 et 13 (énergie} d’interaction < -10 kcal/mol) (Tableau III.7).

En comparaison avec les valeurs énergétiques du Tableau III.6, on constate que les interactions du peptide ont changé. Certaines se sont renforcées tandis que d’autres se sont affaiblies. Ces variations sont dues à un léger changement conformationnel du peptide lors de l’amarrage. En effet, la boucle peptidique située entre les résidus 7 et 13, est différente dans

Tableau III.7 : Énergies d'interaction 2 -10 kcal/mol entre les acides aminés de pF1 et la protéine EcFur1111Vc.

Résidus pF1 E inter (kcal/mol)

R1 -11,8 L2 -10,5 W3 -24,3 C4 -11,6 R5 -34,8 Y6 -12 H8 -13,3 D13 -13,8 Y130 R70 R5 W3 D13 Y6 Y130 R57

les deux amarrages de pF1 sur EcFur_{1Pa et EcFur1Vc et cela a peut-être joué sur l’énergie} libre ∆G observée.

L’analyse des liaisons hydrogènes entre le peptide et la protéine après un raffinement par minimisation d’énergie (100 pas de SD suivi de 1000 pas d’ABNR) avec CHARMM avec un « cutoff » de distance de 2,4 Å et d’angle de 120° est présentée sur le Tableau III.8.

Peptide Einter (kcal/mol) Protéine

Résidus Atomes Résidus Atomes

R1 HH12 -2,1 D64 (A) OD2 HH22 -2,8 D64 (A) OD2 O -3,3 G75 (B) H L2 O -3,1 E74 (B) H W3 H -2,5 N72 (A) O O -3,4 N72 (A) H HE1 -3,6 Y130 (B) OH C4 H -3,2 N72 (B) O O -3,4 N72 (B) H R5 H -3,6 N72 (A) O HH21 -6,4 Y130 (A) OH O -3,5 E74 (A) H HH11 -3,1 S126 (B) OG HH12 -6,4 Y128 (B) OH HH22 -3,9 S126 (B) OG Y6 OH -6,7 R70 (A) HH21 H8 O -4,1 R70 (B) HH11 T12 HG1 -4,7 Y56 (A) OH D13 OD1 -4,5 R57 (B) HH11 O -6,7 R57 (B) HH21

Tableau III.8: Énergies d'interaction entre atomes de pF1 et VcFur_{1111Vc formant des liaisons hydrogènes.}

Les résidus et atomes de la protéine sont colorés en vert et en rouge respectivement pour le monomère A et B. Les atomes HH, HG et OG sont des notations des types d’atomes des chaines latérales dans CHARMM (voir Figure III.26).

Nous venons de voir dans le Tableau III.7, les énergies d’interaction des résidus de pF1 interagissant fortement avec la protéine. Les résidus de la protéine intervenant dans la liaison avec le peptide sont illustrés dans le Tableau III.8. Ces résidus protéiques contribuant à l’interaction avec pF1 par des liaisons hydrogènes sont les Y56, R57, D64, R70, N72, D64, E74, G75, S126, Y128 et Y130. Les énergies d’interaction des résidus protéiques interagissant essentiellement via le « backbone » ; E74, N72, G75, sont faibles comparées aux interactions des chaines latérales.

Les résidus protéiques qui interagissent donc fortement avec pF1 par leurs chaines latérales sont :

• D64 qui interagit avec R1 ou D13 de pF1

• R57 interagissant avec D13 de pF1

• R70 qui interagit avec Y6 de pF1

• Y56 interagissant avec T12 de pF1. Cette tyrosine avait été identifiée comme interagissant avec les bases de l’ADN (Tiss et al. 2005).

• Y128 et Y130 qui interagissent avec pF1.

• Y130 interagit avec W3 de pF1

• S126 avec R5 de pF1.

Nous allons maintenant voir les amarrages des autres séquences tronquées et/ou mutées de pF1 avec EcFur1Vc et pouvoir comparer les résultats avec ceux des tests expérimentaux.

III. C. 2. b| Amarrage de séquences tronquées de pF1

Afin de vérifier l’importance des interactions de pF1 proposées et aussi pour prédire les mutations à effectuer dans les tests d’activité biochimique, nous avons réalisé des amarrages des peptides tronqués/mutés de pF1 sur le modèle EcFur_{1Vc. Le Tableau III.9} résume les résultats des séquences de pF1 qui inhibent EcFur in vitro dans les tests d’activité biochimiques (confère chapitre II).

Tableau III.9: Récapitulatif des énergies libres et constantes d’inhibition calculées de séquences tronquées de pF1 interagissant avec le modèle EcFur3Vc

Tous ces amarrages montrent que le peptide interagit favorablement dans le site actif d’EcFur que nous venons de voir (Figure III.26 et Figure III.27). L’énergie libre de liaison est inférieure à -12 kcal/mol pour toutes ces séquences. Les résidus W3, C4, R5, Y6 et H8 contenus dans la séquence pF1(3-9), interagissent fortement avec la protéine (Tableau III.7).

Notations séquences pF1 ∆∆∆∆G (kcal/mol) Ki (pM)

pF1 (1-13) RLWCRYPHPPLTD -19 0,007 pF1 (1-10) RLWCRYPHPP -18 0,07 pF1 (1-9) RLWCRYPHP -17 1 pF1 (1-8) RLWCRYPH -17 1 pF1 (2-9) LWCRYPHP -14,5 24 pF1 (3-9) WCRYPHP -13 395

On avait montré expérimentalement que cette séquence était la plus petite pour inhiber EcFur. Lorsqu’une mutation touche à l’un de ces résidus, le peptide n’inhibe plus la protéine (confère chapitre II). De plus, les expériences biochimiques ont montré que les résidus R1-L2 et P10- D13 ne sont pas indispensables pour inhiber la protéine. De la même façon, lorsqu’un des résidus W3, C4, R5, Y6 et H8 est absent dans la séquence de pF1, l’énergie libre de liaison avec la protéine diminue Ces résidus sont donc très importants pour l’interaction avec la protéine comme nous venons de le voir dans ces résultats de « docking ». Ils sont aussi indispensables pour inhiber l’activité de la protéine comme on l’a vu dans les résultats des tests biochimiques. Ces résultats d’amarrage de pF1 sur la protéine sont donc en accord avec ceux des expériences biochimiques réalisées. Toutefois, la séquence pF1(1-8) interagit favorablement en théorie avec Fur avec une énergie libre de liaison identique à celle obtenue pour le peptide pF1(1-9). Or pF1(1-8) n’est pas actif expérimentalement. Le « docking » prévoit donc une affinité forte de pF1(1-8) pour Fur qui n’a pas été confirmée par les expériences in vitro. Les tests biochimiques indiquent que la proline P9 de pF1 est essentielle à l’inhibition de la protéine. La Figure III.28 présente l’amarrage de pF1(3-9) qui est donc la séquence minimale active de pF1 (sept acides aminés).

Figure III.28: Amarrage de pF1(3-9) sur EcFur11Vc. 11

Cet amarrage a une énergie libre de liaison de -13 kcal/mol, très favorable, compatible avec les résultats biochimiques comme nous venons de le voir.