Automates disponibles

1. PCR simplex

Les premières PCR ont fait leurs apparitions en laboratoire de routine vers 2004, il s’agissait de PCR classiques qui détectait une seule cible (PCR simplex) et dont les étapes (extraction, amplification et détection) étaient réalisées à l’aide de différents appareils. C’est une technique dite en point final, c’est-à-dire que les

fragments d’ADN étaient détectés en fin de réaction soit par couplage avec une technique ELISA soit par migration sur gel d’agarose après un marquage par un intercalant de l’ADN (bromure d’éthidium) pour visualiser les bandes.

La PCR simplex présente plusieurs avantages, elle permet de cibler les prescriptions des cliniciens lors de symptômes cliniques évocateurs.

Figure 18 Automate GeneXpert® de Cepheid.

En 2007 les PCR spécifiques dite en temps réel ont été commercialisées. Il s’agit toujours d’une technique simplex, cependant contrairement aux techniques de PCR classique, la détection est réalisée durant la PCR, par l’utilisation de sondes fluorescentes (dont Taqman et SYBR green) qui résistent aux différentes températures des étapes de la PCR. Cette méthode permet de suivre la progression de la PCR tout au long de la réaction, il s’agit d’une analyse quantitative.

Ces systèmes sont généralement plus sensibles que les mPCR (PCR multiplex) et permettent d’obtenir un résultat rapide avec un coût moins important que les techniques multiplex.

2. Trousses syndromiques

Ces systèmes font intervenir différents appareils pour les étapes d’extraction, d’amplification et de détection qui sont réalisées séparément à des temps différents. Cela implique une durée totale d’analyse plus longue pour la plupart de ces systèmes, un temps de manipulation également plus important et ils nécessitent généralement un personnel qualifié et formé, dédié à cette activité.

Ce système permet la détection de 26 agents pathogènes respiratoires par l’utilisation de 4 panels.

Panel 1

Grippe A, grippe B, VRS A, VRS B, grippe H1, grippe H1N1 2009, grippe H3.

Panel 2

Adénovirus, entérovirus, parainfluenza 1, 2 3 et 4, métapneumovirus.

Panel 3

Bocavirus, rhinovirus, coronavirus NL63, 229E, OC43.

Panel 4

Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis.

Il est possible d’associer différents panels.

Le principe de cet automate repose sur une PCR en temps réel, qui permet de quantifier plusieurs cibles grâce à la valeur de nombre de cycle (Ct) qui est propre à chaque cible.

Figure 19 Automate Allplex® de Seegene.

RespiFinder

Cet automate permet la détection de 21 pathogènes, grâce à un ensemble de sondes marquées par un fluorochrome. Une fois la PCR terminée, l’analyse des

courbes de fusion permet la différenciation des acides nucléiques des pathogènes ciblés.

Les virus :

Adénovirus, bocavirus, coronavirus 229E, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, métapneumovirus, grippe A, grippe A H1N1, grippe B, parainfluenza 1,2,3 et 4, rhinovirus/entérovirus, VRS A, VRS B.

Les Bactéries :

Bordetella pertussis, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae.

3. PCR multiplex syndromique

Dernièrement, des techniques multiplex syndromiques ont été mis au point, permettant d’élargir le nombre de cibles, en créant des panels selon les symptômes cliniques des patients. Ces techniques présentent certains avantages, elles permettent notamment d’obtenir des résultats en moins de 45 minutes pour certains automates. Elles permettent également de réaliser les examens, patients par patients et non en séries, ce qui est intéressant particulièrement en cas de demande urgente d’un service clinique. Cependant cette technique est très onéreuse ce qui impose d’adopter une stratégie d’utilisation. Ces automates utilisent des cassettes où toutes les réactions de PCR traditionnelles (lyse de l’échantillon, extraction des acides nucléiques, amplification et détection) sont réalisées. Il s’agit de tests unitaires où le temps de manipulation technique est réduit et où les résultats sont rendus dans un délai assez court (1 à 2 heures).

Eplex®

Le panel ePlex® RP de GenMark/ELITech permet la détection de 24 pathogènes respiratoires. La préparation de la cassette se réalise en 2 minutes et on obtient un résultat en 90 minutes.

Figure 20 Automate ePlex® de GenMark/ELITech

Cet automate utilise la PCR en microfluidique et la détection se fait par électrochimie (cf matériels et méthodes).

FilmArray® de Biofire

FilmArray® intègre la lyse de l’échantillon, l'extraction des acides nucléiques, l’amplification, la détection et l’analyse dans un système simple qui nécessite 2 minutes de préparation pour une durée totale d’analyse de 45 minutes (55).

Figure 21 Automate Fimarray® de Biofire.

Le panel respiratoire (RP2plus) commercialisé sur l’automate FilmArray®_{permet la} détection de 22 virus et bactéries respiratoires. Le tableau suivant décrit les pathogènes recherchés par le panel respiratoire RP2plus.

Cet automate utilise la PCR en microfluidique et la détection se fait par l’étude des courbes de fusion (détermination des températures de fusions propres aux produits de PCR).

Verigene® de Luminexcorp

Verigene® est un automate de PCR multiplex utilisant un panel variable de pathogènes respiratoires et pouvant détecter jusqu’à 16 bactéries et virus fréquemment incriminés dans les infections respiratoires. Le panel est à la carte en fonction des besoins du clinicien, on peut sélectionner les microorganismes suspectés, on évite la recherche des autres agents du panel. En effet l’épidémiologie des pathogènes respiratoires varient selon la période de l’année, la localisation géographique et l’état de santé du patient.

Le coût de ce système constitue un avantage car les réactifs utilisés pour chaque agent sont achetés séparément, ce qui implique que cette technique coute moins cher que les autres automates multiplex.

Figure 22 Automate Verigene® de Luninexcorp.

Voici les pathogènes recherchés par le panel Verigene RP Flex® :

Les virus :

Adénovirus, métapneumovirus, grippe A, grippe A sous-type H1, grippe A sous type H3, grippe B, parainfluenza 1, 2, 3 et 4, rhinovirus, VRS A et B.

Les bactéries :

Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis Bordetella holmesii.

Cette technologie fait appel aux puces à ADN, dont le principe consiste à mettre en contact des sondes (spécifiques d’un gène) avec des ARNs cibles extraits d’échantillons à analyser, ces ARNs sont marqués par des fluorochromes. Après la phase d’hybridation, une acquisition des images permet la quantification des produits d’hybridation, on obtient ainsi le reflet du niveau d’expression des différents gènes présents sur la puce.