Assemblage de génome par homologie

Lorsqu’un génome de référence est disponible et que l’on recherche des polymorphismes de séquence tels que les SNP, une standardisation des génomes peut s’avérer utile. Un assemblage par homologie est alors conseillé. On parle de « mapping » des lectures de séquençage sur le génome de référence : elles sont alignées sur le génome de référence en fonction d’un pourcentage d’identité. Le génome final obtenu a une taille similaire au génome de référence. Avec cette approche, un certain nombre d’informations seront perdues, telles que certaines insertions-délétions, ce qui implique de bien choisir la stratégie à adopter en rapport avec la finalité du projet.

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Zoonose aiguë potentiellement mortelle, la fièvre charbonneuse peut infecter tous les mammifères, humains compris, ainsi que quelques espèces d’oiseaux. Les herbivores sont les plus touchés. Ils contractent généralement la maladie en ingérant des spores, qui constituent la forme infectante de la bactérie, au cours de leur pâture. Chez l’Homme, le contact d'animaux infectés, l’ingestion d’aliments contaminés ou la respiration de poussières contenant des spores, sont responsables de la maladie. Le réservoir naturel est le sol. Sous sa forme sporulée, B. anthracis peut survivre durant de longues périodes dans les sols où il se trouve. De par ses caractéristiques et son pouvoir pathogène, le bacille du Charbon a toujours été considéré comme une arme biologique potentielle.

De répartition mondiale, la maladie reste endémique dans certaines régions du globe alors qu’elle est peu prévalente dans d’autres. Classée dans la liste de l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE), la fièvre charbonneuse fait partie en France des maladies réglementées de catégorie 1 (articles L.223-2 et suivants, et D.223-2 du Code rural) et donne lieu à l’application de mesures de police sanitaire. Elle est reconnue comme maladie professionnelle et est redevenue une maladie à déclaration obligatoire chez l’Homme depuis 2001.

En Europe, on retrouve la maladie dans la plupart des pays. En France, elle apparait de façon sporadique selon les années en fonction de la météorologie, de l’arrêt des vaccinations ou de l’activité humaine impactant le sol. Certaines années ont été particulièrement propices au développement de la maladie. Ce fut le cas en 2008 dans le Doubs (Calavas et al., 2008) ainsi qu’en 2009 (Madani et al., 2009).

B. anthracis, espèce jeune sur le plan phylogénétique, est considéré comme un des pathogènes les plus clonaux, faisant preuve d’une très grande homogénéité sur le plan génomique. Les souches sont extrêmement proches les unes des autres et il n’est pas aisé de les différencier en utilisant les méthodes classiques. Identifier clairement l’origine d’une contamination ou la souche impliquée dans un foyer de fièvre charbonneuse est une donnée importante, qui facilite l’analyse des causes et les décisions de gestion sanitaire. Ainsi, la stratégie thérapeutique, en particulier l’antibiothérapie, ou la traçabilité d’une tentative malveillante seront plus facilement mises en place. Plusieurs méthodes de différenciation de la bactérie ont été testées au cours des 20 dernières années, certaines avec plus de succès que d’autres. Parmi les méthodes récente les plus prometteuses, on peut citer la MLVA, les SNP et les SNR, méthodes robustes, précises et présentant un pouvoir discriminant important. Toutefois, c’est désormais le séquençage à haut débit du génome complet qui permet d’étudier le plus précisément les relations phylogénétiques d’une espèce bactérienne tout en réalisant le génotypage de cette espèce.

L’objectif de cette thèse était de développer une méthode de typage rapide, robuste et à haut pouvoir discriminant, utilisable pour le diagnostic et l’épidémiologie des foyers de charbon en France et en Europe. Un tel outil représente un intérêt évident pour la sécurité intérieure afin de détecter rapidement toute diffusion accidentelle ou malveillante de ce germe et de réagir vite et de manière adaptée. Le but ultime de ce travail est d’acquérir la capacité de distinguer suffisamment de différences entre deux souches de façon à déterminer avec certitude qu’une souche particulière est à l’origine d’une infection naturelle ou d’un acte de malveillance, ainsi que l’acquisition de suffisamment d’informations pour identifier l’origine géographique de toute souche de B. anthracis présente sur Terre.

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Pour ce faire, deux axes de travail ont été développés : dans un premier temps, étudier la diversité des souches de B. anthracis isolées en Europe via une approche de séquençage à haut débit (à partir de la collection de souches du LNR (124 souches) ainsi que sur une centaine de souches d’origines diverses (issues de collaborations inter-laboratoires)), puis, dans un second temps, identifier des marqueurs génétiques rares et discriminants. L’identification de marqueurs polymorphes « évolutivement » stables à l’origine de cette diversité était un préalable au développement d’un outil de typage moléculaire précis, rapide et peu coûteux, adapté à la caractérisation des souches naturellement présentes en France et dans le monde. Le principal avantage est de disposer d’un outil discriminant sans avoir à recourir au séquençage.

Plusieurs objectifs spécifiques ont été définis à partir du séquençage de près de 250 isolats et l’obtention du génome complet des souches séquencées :

1) Etudier la biodiversité des isolats français de B. anthracis et proposer un premier panel de marqueurs polymorphes visant à développer un outil de typage moléculaire rapide et précis 2) Investiguer les relations phylogénétiques existantes entre les isolats français et mondiaux et

identification de panels complémentaires de marqueurs polymorphes destinés à être utilisés en typage moléculaire pour identifier rapidement toute souche

3) Développement de deux méthodes de biologie moléculaire capables de discriminer des mutations ponctuelles de type SNP : la PCR-HRM et le Luminex.

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ETUDE EXPERIMENTALE

Chapitre 1:

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1. Utilisation des SNP sur génome complet pour étudier la diversité des souches françaises de B.