Chapitre 2 : Synthèse d’un lipide hémifluoré et étude de cristallisation 2D de
B. Différentes approches utilisées pour concentrer et orienter les protéines à la surface du
1. Adsorption électrostatique
Des interactions de nature électrostatique ont pu être utilisées avec des lipides cationiques pour orienter électrostatiquement une protéine soluble, la polymérase ARN II8, qui a finalement permis la détermination d’une structure 3D de 2,8 Å grâce à des cristaux 3D développés à partir de cristaux 2D obtenus sur un film lipidique9.
Cependant, la méthode d’adsorption électrostatique n’a pas été plus largement utilisée en raison des zones multiples de sites chargés en surface des protéines, qui provoquent généralement en fonction du pH et de la force ionique de la solution une multitude d’orientations à l’interface, qui rendent difficile la cristallisation 2D des protéines par cette voie.
7 D.R. Shneck, D.W. Pack, D.Y. Sasaki and F.H. Arnold, Langmuir, 1994, 10, 2382-2388 ; W. Frey, W.R. Schief Jr., D.W. Pack, C.T. Chen, A. Chilkoti, P. Stayton, V. Vogel and F.H. Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1996, 93, 4937-4941 ; C. Vénien-Bryan, P.F. Lenne, C. Zakri, A. Renault, A. Brisson, J.F. Legrand and B.
Berge, Biophys. J., 1998, 74, 2649-2657 ; I.T. Dorn, K.R. Neumaier and R. Tampé, J. Am. Chem. Soc., 1998, 12, 2753-2763.
8 M. Edwards, S.A. Darst, W.J. Feaver, N.E. Thompson, R.R. Burgess and R.D. Kornberg, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A, 1990, 87, 2122-2126 ; P. Schultz, H. Célia, M. Riva, S.A. Darst, P. Colin, R. D. Kornberg, A. Sentenac
and P. Oudet, J. Mol. Biol., 1990, 216, 353-362.
9 P. Cramer, D.A. Bushnell and R.D. Kornberg, Science, 2001, 292, 1863-1876 ; P. Cramer, D.A. Bushnell, J. Fu, A.L. Gnatt, B. Maier-Davis, N.E. Thompson, R.R. Burgess, A.M. Edwards, P.R. David and R.D. Kornberg,
2. Interactions spécifiques ligand-protéine
Par la suite, différents lipides conjugués à un ligand ont été synthétisés au cas par cas pour permettre l’immobilisation spécifique de protéines solubles grâce à des interactions spécifiques ligand-protéine comme par exemple un stéroïde10, un motif biotine pour la streptavidine11, un motif novobiocine pour des gyrases d’ADN12, un motif ATP pour les protéines se liant à l’ATP13, ou encore un motif DNP pour les anticorps IgG et IgE anti-DNP14 (Figure 2-2). O O PO P X P OH N N N N NH H N N O O O O OH OH OH OH OH O n X = CH2, n = 1,3 X = O, n = 3 ATP O O P O N H O H O O O O O N H O S NH HN O Biotine O O PO N H O H O O O O O H N O2N NO2 DNP O O P O O n O HO O O O O H N O OH O O O O OH H2N O O O O Novobiocine
Figure 2-3 : Lipides synthétiques conjugués à un ligand pour l’immobilisation et la cristallisation de protéines
spécifiques.
10 L. Lebeau, P. Oudet and C. Mioskowski, Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 1697–1706. 11
C. Ku, S.A. Darst, R.D. Kornberg, C.R. Robertson, A.P. Gast, Langmuir, 1992, 8, 2357-2360 ; J. Spinke, M. Liley, H. Guder, L. Angermaier, W. Knoll, Langmuir, 1993, 9, 1821-1825 ; A.C. Ku, S.A. Darst, C.R. Robertson, A.P. Gast, R.D. Kornberg, J. Phys. Chem., 1993, 97, 3013-3016 ; A.J. Avila-Sakar, W. Chiu,
Biophys. J., 1996, 70, 57-68.
12
L. Lebeau, E. Regnier, P. Schultz, J.C. Wang, C. Mioskowski and P. Oudet, FEBS Lett., 1990, 267, 38-42 ; H. Celia, L. Hoermann, P. Schultz, L. Lebeau, V. Mallouh, D.B. Wigley, J.C. Wang, C. Mioskowski, P. Oudet, J.
Mol. Biol., 1994, 236, 618-628.
13 L. Schmitt and R. Tampé, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5532-5543. 14
Cependant, cette stratégie reste limitée puisqu’elle nécessite de préparer des lipides possédant une affinité unique pour chaque nouvelle protéine étudiée. De telles synthèses peuvent s’avérer difficiles et nécessiter beaucoup de temps et d’argent. De même, les structures de protéines étudiées ne sont pas connues et il est difficile de prévoir avec certitude si les protéines disposent de sites de fixation adéquats aux ligands introduits sur les lipides. Cette situation a donc conduit les chercheurs à trouver une méthode plus générale pour promouvoir des interactions spécifiques entre les protéines et un film lipidique.
3. Interactions d’un ligand métallique avec une séquence polyhistidine
En 1975, le concept de chromatographie d’immobilisation par affinité métallique (IMAC)15 a été introduit pour la séparation des acides nucléiques et des protéines. Cette méthode a été remaniée en introduisant le ligand classique de chélation des métaux de transition, l’acide nitrilotriacétique (NTA), en modifiant les résidus lysine d’une résine de chromatographie16.Le NTA est un ligand tétradentate capable d’occuper quatre positions dans la sphère de coordination des métaux de transition, laissant deux positions disponibles pour des interactions avec les protéines portant les ligands appropriés à la coordination de l’ion métallique. Par exemple, l’ion Ni2+ ayant une configuration électronique 4s03d84p04d0 dans sa couche de valence s’hybride pour constituer six orbitales hybrides d2sp3 de même énergie avec une géométrie identique dans une structure octaédrique lui permettant de complexer six ligands. N H Ni O O O O O O NH HN O O OH N N H O N H N N H His O Résine IMAC Résidus histidine Ligand NTA Protéine recombinante portant une séquence his-tag n
Figure 2-5 : Schématisation du complexe octaédrique d’un ligand NTA avec un métal de transition et une
protéine recombinante portant une étiquette His-Tag.
15 J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson and G. Belfrage, Nature, 1975, 258, 598-599. 16
Etant donné que le résidu histidine est un ligand ayant une bonne affinité pour les métaux de transitions, des protéines recombinantes ont donc été conçues avec un ligand chélatant biosynthétique contenant une séquence répétitive d’au moins six résidus histidines (noté « his-tag ») située généralement à l’extrémité C- ou N-terminale de la protéine, pour être facilement purifiée sur une résine IMAC (Figure 2-3).
Des constantes d’équilibre de Kd ≈ 10-7 M17 et 8.10-10–10-13 M18 ont été reportées respectivement pour les interactions his6-protéine:M2+ et NTA:Ni2+. Les technologies IMAC basées sur l’utilisation de ligands NTA sont maintenant largement utilisées avec les ions Ni2+ (ou Co2+) pour purifier les protéines recombinantes his-tag dans les études biochimiques.
Cette avancée a donc conduit à la fusion du concept IMAC avec la cristallisation 2D sur film lipidique pour donner de nouvelles opportunités de produire des cristaux 2D en combinant les avantages des interactions spécifiques his-tag:M2+:NTA et les propriétés d’auto-assemblage des lipides. La localisation spécifique et invariable du motif his-tag sur la protéine recombinante est primordiale pour immobiliser et contrôler l’orientation de la protéine à l’interface, ce qui est nécessaire pour promouvoir efficacement le processus de cristallisation 2D (Figure 2-4).
= Lipide diluant = Lipide chelaté à Ni2+
Protéine recombinante portant une étiquette his-tag =
Adsorption des protéines
sur le film mixte de lipides Diffusion latérale et cristallisation
Figure 2-7 : Représentation du concept hybride de la cristallisation 2D de protéines recombinantes induite par
les interactions spécifiques his-tag :Ni2+:NTA-Lipide.
Il a été démontré que le processus de fixation et l’émergence en surface des protéines recombinantes tag sont clairement provoqués par la complexation protéine
17 T. Dorn, K. Pawlitschko, S.C. Pettinger and R. Tampé, Biol. Chem., 1998, 379, 1151-1159 ; V. Prachayasittikul, C.I.N. Ayudhya, L. Hilterhaus, A. Hinz, T. Tantimongcolwat, H.J. Galla, Biochem. Biophys .
Res. Commun., 2005, 327, 174-182.
18 J. Schmitt, H. Hess and H.G. Stunnenberg, Mol. Biol. Rep., 1993, 18, 223-230 ; T. Stora, R. Hovius, Z. Dienes, M. Pachoud, H. Vogel, Langmuir, 1997, 13, 5211-5214 ; D. Tareste, F. Pincet, M. Brellier, C. Mioskowski, E. Perez, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 3879-3884.
tag:Ni2+:lipide NTA19. La complexation des ions métalliques sur la monocouche lipidique affecte l’isotherme de compression d’un film lipidique qui peut être mesuré avec une balance de Langmuir20.
Des études supplémentaires ont montré que des protéines dépourvues de motifs his-tag ne se fixent pas à des monocouches de lipides-NTA complexés à des ions Ni2+.21 Il est donc clair que la présence éventuelle dans l’enchaînement primaire des protéines d’un aminoacide de type histidine ne suffit pas à provoquer la complexation du nickel. La multiplication de ce motif histidine semble donc indispensable à la complexation du nickel. Des différences de cinétique de fixation des protéines aux lipides NTA peuvent également être observées en raison de la différence d’accessibilité des motifs his-tag sur la protéine recombinante.
La complexation des protéines his-tag aux lipides NTA:Ni2+ peut également être contrôlée et inversée soit par addition d’un excès d’imidazole par compétition avec les résidus histidines, soit par complexation des ions métalliques avec un agent chélatant plus fort tel que l’EDTA, ou encore en abaissant le pH jusqu’à protoner les résidus histidines et les ligands NTA. Ces possibilités offrent des avantages supérieurs aux systèmes basés sur des interactions spécifiques ligand-protéine qui manquent effectivement de réversibilité.