Approche expérimentale et résultats

Après avoir établi les géométries des dispositifs, les étapes suivantes, expérimentales, consistent en la fabrication et la caractérisation. Les procédés utilisés pour la microfabrication sont dé-taillés dans la partie2.4.

Les expériences de caractérisation ont été conduites autour de trois approches, qui seront exposées successivement :

— le suivi de positions d’objets individuels ou de population d’objets, pour valider le modèle présenté un peu plus haut,

— la vérification de la gamme du rayon de coupure par "encadrement" avec des tailles de particules différentes,

— et le mélange réactif avec une application au marquage de cellules par des particules magnétiques.

Le setup expérimental est détaillé au paragraphe2.5. Un support de puce microfluidique et un contrôleur de pression sont utilisés, ainsi qu’un ensemble comprenant un microscope inversé, un diviseur de faisceau et une caméra pour la l’imagerie de billes et cellules en fluorescence.

Deux expériences sont présentées pour le suivi d’objets et la détermination de la déviation due à la recirculation, une incluant des billes calibrées de 15μm, et l’autre avec des cellules (dont le diamètre moyen est d’environ 15μm également).

FIGURE2.18 – Étude de la déviation de particules pour une géométrie de bypass type B2 (r_c =3μm). a) Schéma du dispositif, de la déviationΔy étudiée et notations. b) Tracés de Δy=f(y0) obtenus par méthodes numériques (lignes noires continues : dichotomie, points bleus et verts : éléments finis pour les étages 1 et 6). Une portion agrandie du graph pour les déviations positives est contenu dans le graph général. c) Tracés deΔy=f(y₀) obtenus par méthode numérique (lignes noires, dichotomie) et par expérience avec des billes de 15μm (points colorés, une couleur par étage). La ligne rouge en pointillés indique la limite de déviation pour une taille de particules de 15μm.

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C

Lb 906 791 1310 1131 1131 1131 1180.4

Vp(nL) 1.250 2.899 4.914 0.040 0.040 0.100 2.740

Vb(nL) 0.841 0.404 0.680 1.775 0.757 0.757 0.877

TABLEAU2.1 – Principales caractéristiques et dimensions des différents systèmes mention-nés. Toutes les distances (dehàLb) sont enμm, les volumes sont en nL. Les designs (A1 à C) sont représentés Fig.2.17, les noms en gras (A1, B1, B2, C) interviennent dans la partie expérimentale.

La déviation de billes de 15μm est réalisée dans un dispositif de type B2 comprenant 6×6=36 étages de bypass (dc =6μm). LeQ^∗pour un tel système est de 1.66·10⁻², il faudrait donc 61 étages pour obtenir un renouvellement du flux total. D’autres dispositifs ont été conçus avec plus d’étages (100 et 300) mais ne présentent pas de fenêtres de visualisation (dédiées à la caractérisation) et sont plus délicats à utiliser en terme de remplissage. Les billes sont injectées uniquement d’un côté de la canalisation (opposé à l’aspiration), et la déviation est observée tous les 6 bypass. Chaque particule est suivie lors de l’acquisition, et sa position est relevée lors des passages élargis de la canalisation principale.

Le schéma de l’expérience et les résultats sont présentés sur la Fig.2.19c-d). La première observation est que le déplacement limite (ligne horizontale sur le graph d) à droite) n’est pas atteint, ce qui est normal (tout le flux n’est pas traité après 36 étages). La distribution des billes ne montre pas de changement de concentration locale : ceci est cohérent avec l’injection des billes d’un seul côté de la canalisation.

Ces résultats sont ensuite analysés en considérant chaque groupe de 6 bypass (positions initiales et déviéesy0ety1pour chaque groupe), et comparés avec le modèle établi précé-demment, voir la Fig.2.18c). On observe deux points importants : pour commencer, chaque groupe de points décrivant un étage est placé sur la courbe correspondante. Ensuite on voit que la limite théorique de déplacement en fonction de la position, pour une bille de 15μm (droite en pointillés rouge), est également respectée avec les résultats expérimentaux. Ainsi le modèle, bien que simple, décrit très bien la déviation des particules.

L’autre expérience de caractérisation de la déviation est réalisée avec des monocytes THP-1, dans des dispositifs de type C (dc=13μm). LeQ^∗est de 0.108 pour ces bypass, ainsi seulement 10 étages sont nécessaires pour traiter tout le flux. Les cellules sont injectées en entrée sur toute la canalisation (position moyenne〈y〉 0), et sont déviées progressivement vers le bord d’aspiration. L’acquisition est réalisée dans le canal principal, avant la réinjection, pour tous les étages : la position de chaque cellule dans cette zone est relevée (schéma Fig.2.19a).

Les résultats sont regroupés dans les deux graphiques Fig.2.19 b). On voit tout d’abord (graphique de droite) que la limite de déviation (due à l’élargissement de la canalisation principale) est atteinte, à la valeur prédite par la théorie (droite horizontale). Les cellules se focalisent donc peu à peu vers le bord d’aspiration, et la dispersion de la population diminue également le long du dispositif (graphique de gauche). Un point à noter (qui diffère de l’expérience précédente), est que la concentration locale au niveau du bord d’aspiration augmente, pour atteindre environ 6 fois la concentration moyenne d’entrée.

Ces deux expériences permettent de valider le modèle théorique, aussi bien pour le déplace-ment que pour les valeurs de position et déplacedéplace-ment limites. La focalisation et la concen-tration (locale) de cellules ont été démontrées. En terme d’efficacité, bien qu’ayant utilisé les mêmes tailles de billes et particules, une comparaison n’est pas possible car les diamètres de coupure des systèmes ne sont pas les mêmes (6μm contre 13μm). En revanche un détail non négligeable est la position finale limite, qui est liée aux dimensions des canaux à l’endroit de l’aspiration et après agrandissement pour l’observation ou la séparation. Pour le dispositif de type C, une faible largeur (w_in=35μm) permet une efficacité importante mais limite la position de sortie à environ−57μm, alors que pour les dispositifs types B (win=50μm), cette limite est de−70μm. Cette limite n’a pas d’importance pour une réaction de marquage, mais impacte l’efficacité d’une opération de tri par taille, si l’on souhaite récupérer uniquement la portion de flux la plus proche de l’aspiration.

La vérification du bon fonctionnement et des rayons de coupure des systèmes en "bypass"

a également été traitée. Pour les premiers dispositifs, il a fallu, après fabrication, s’assurer de leur bon remplissage et que des billes puissent emprunter les deux chemins possibles (canal principal / bypass). L’injection de billes fluorescentes de 2.3μm dans des bypass type A1 (dc=12μm) a permis cette vérification (Fig.2.20a).

Il est plus délicat de caractériser avec précision les rayons de coupure en utilisant des particules.

L’étude de la déviation de particules peut apporter cette mesure de manière indirecte. Une autre méthode est de procéder à un encadrement avec deux tailles de particules, ainsi des particules fluorescentes (Invitrogen FluoSpheres) de 5μm (vertes) et 2μm (rouges) ont été injectées dans un dispositif de type B1 (dc=3μm), voir Fig.2.20b-c). Seules les particules de 2μm sont aspirées dans les bypass.

La même expérience est réalisée avec des tailles différentes pour les systèmes type B2 (dc= 6μm, où des particules de 5μm (vertes) et de 15μm (bleues) sont injectées. La Fig.2.20d) montre la trajectoire d’une particule de 15μm traversant le système alors que des particules de 5μm sont présentes dans les bypass.

FIGURE2.19 – Expériences de caractérisation : trajectoires d’objets. a-b) Caractérisation de la distribution enyd’une population de cellules (monocytes THP-1) pour 10 étages (bypass type C), avec une répartition homogène en entrée. b)Histogramme en fréquence des cellules en fonction dey(nombre de cellules pour la population = 126 en entrée, 183 en sortie), et tracé de〈y〉 ±σpour chaque étage. c-d) Caractérisation de la position d’une bille de 15μm pour N = 36 étages (observations tous les 6 bypass), dispositifs de type B2. d) Histogramme en fréquence pour la position de chaque bille (nombre total de billes observées = 33), et tracé de

〈y〉 ±σpour chaque groupe de 6 étages. Les fenêtres rouges schématisent l’acquisition (fixe pour un ensemble de cellules, ou suivi d’une bille). Les lignes noires horizontales sur b-d) à droite montrent la limite en position due aux élargissements de canalisations.

FIGURE2.20 – Images de microscopie de fluorescence pour la séparation par taille, l’analyse de trajectoires et le marquage cellulaire. Sur b) et d) les murs des canalisations (lignes blanches) ont été ajoutées pour plus de lisibilité. a) Démonstration de fonctionnement pour un dispositif type A (SU-8) avec des billes fluorescentes de 2.3μm (dc12μm). b) Tri par taille de particules de 5μm (vertes) et 2μm (rouges). c) Vue agrandie pour la même expérience (même dispositif ) que pour b). d) Trajectoire (déviation) d’une bille de 15μm (bleue) dans une solution avec des billes de 5μm (vertes). e) Monocytes (noyaux marqués en fluorescence à l’Hoechst 33342) marqués avec des billes magnétiques (vertes) de 1μm. Les barres d’échelle sont de 100μm pour a), b) et d), et de 50μm pour c) et e).

Enfin une expérience de marquage a aussi été réalisée avec ces dispositifs de type B2. Des cellules THP-1 (dont les noyaux ont été marqués à l’Hoechst) sont mélangées avec des billes magnétiques fluorescentes de diamètre 1μm. Les dispositifs disposent de deux en-trées (Pi n=100 mbar et une sortie (Pout=0 mbar). Une solution de billes marquées avec des anticorps anti-CD14 (5.4·10⁸billes/mL) et une solution de cellules THP-1 (5·10⁵cellules/mL sont injectées à chaque entrée. Le marquage n’a pu être observé directement sur puce, dû essentiellement à la vitesse de flux élevée pour éviter la sédimentation des particules dans les bypass, et à un signal de fluorescence faible comparé à l’autofluorescence du matériau. La solution à la sortie a été prélevée et placée sur une lame de verre. Des cellules marquées (voir Fig.2.20e) ont ainsi été observées.

Conclusion

Cette partie dédiée aux systèmes à dérivation (bypass) est fortement liée aux travaux consacrés à la filtration hydrodynamique. En introduisant une structure 3D simple, il est possible de rendre un procédé plus efficace (Q_{t ot}^∗ =NQ^∗) mais aussi d’apporter de nouvelles fonctions.

Au delà de la fabrication des puces, une cohérence entre le modèle proposé pour la déviation (trajectoire) des particules et les résultats obtenus expérimentalement a été montrée. Divers géométries ont permis d’avoir accès à une gamme de diamètres de coupure comprise entre 3 et 13μm, ce qui a été confirmé avec différentes tailles de particules. Enfin la preuve de concept pour le marquage de cellules sur puce avec cette technique a été présentée.