Approche de biologie synthétique

Dans le but de modifier le génome des mycoplasmes à grande échelle, des outils faisant intervenir la BS ont été récemment mis en place. Cette approche repose sur trois étapes majeures, le clonage du génome entier dans la levure, la modification de ce génome avec les outils génétiques efficaces de la levure et la transplantation du génome modifié dans une cellule receveuse afin qu’il puisse s’exprimer. Les premières études montrant ces outils ont été réalisées au JCVI à la fin des années 2000 (Lartigue et al., 2007; Gibson et al., 2008a). Ces travaux ont permis d’ouvrir la voie à de nouveaux outils génétiques chez les mycoplasmes.

En effet, la levure S. cerevisiae a longtemps été utilisée comme hôte pour propager des fragments d'ADN d'organismes variés allant de virus à l'ADN humain à l'aide par exemple de "Yeast Artificial Chromosomes" (YAC) (Ketner et al., 1994; Larionov et al., 1996; Kouprina

et al., 1997; Wang et al., 2003). C’est la méthode de TAR-cloning qui permet d’utiliser la levure comme un outil en y intégrant de l’ADN ; elle est basée sur la capacité de cet organisme à effectuer la recombinaison homologue (Kouprina and Larionov, 2006). Comme évoqué dans la section 2, La biologie de synthèse, le premier génome de mycoplasme à avoir été cloné dans la levure a été celui de M. genitalium, pour lequel des cassettes de milliers d’oligonucléotides ont été assemblées dans E. coli, puis dans S. cerevisiae afin d’obtenir le génome entier de cette bactérie chez la levure après des étapes de recombinaison homologue (Kouprina and Larionov, 2003; Gibson et al., 2008b). Afin de maintenir l’ADN dans la levure, plusieurs éléments sont requis et sont ajoutés aux fragments à cloner. Il s’agit d’éléments levure : un marqueur d’auxotrophie histidine (HIS), un centromère (CEN) et une origine de réplication de levure (ARS), qui sont nécessaires à la sélection et la réplication dans la levure tel un plasmide centromérique.

À l’heure actuelle, de nombreux génomes bactériens ont été clonés dans la levure, comme M. genitalium (Gibson et al., 2008a; Gibson et al., 2008b; Benders et al., 2010),

M. mycoides (Lartigue et al., 2009; Benders et al., 2010; Gibson et al., 2010), M. pneumoniae

Figure 11. Délétion génétique sans trace par la méthode TREC, issu de Noskov et al. (2010). Par recombinaison homologue, une région de 450 pb dans le génome de M. genitalium est remplacé par une cassette de mutagenèse contenant un « core » d’inactivation (un site de reconnaissance de 18 pb I-SceI, le gène sceI sous le contrôle du promoteur GAL1 et le marqueur URA3) et un fragment d’ADN (flèche blanche) identique à la région en amont de la région cible. Le remplacement génère des séquences répétées en tandem. Le galactose induit l’expression de I-SceI qui va créer une coupure double-brin près du site cible. La cassure double-brin provoque une recombinaison homologue intra-moléculaire (pointillés) entre les séquences répétées, entrainant une excision du « core ». Lors de la méthode TREC-IN (Chandran et al. 2014), le gène à insérer est ajouté derrière la séquence répétée dans le « core » de mutagenèse.

55

et al., 2012), H. influenzae (Karas et al., 2013) et M. florum (Baby et al., 2018a). Ces génomes ont des tailles comprises entre 0,6 et 1,8 Mb et un GC % variant de 24 à 40 %. Une fois le génome cloné dans la levure, il est modifié par les outils génétiques disponibles chez cet organisme. Ces techniques sont basées sur les propriétés de recombinaison homologue de la levure et trois différentes méthodes sont à l’heure actuelle utilisées pour modifier les génomes de mycoplasmes, les méthodes TREC et TREC-IN (Figure 11), (Noskov et al., 2010; Chandran

et al., 2014), et la méthode CRISPR (Tsarmpopoulos et al., 2016).

La méthode TREC (« Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage ») permet de modifier le génome bactérien sans trace et requiert deux évènements de recombinaison. Pour cela, la région cible est tout d’abord remplacée par une cassette de mutagenèse contenant un site de reconnaissance de l’enzyme I-SceI, le gène sceI sous le contrôle du promoteur GAL1, un marqueur de sélection uracile (URA3) et une séquence homologue de 50 pb en 5’ du gène cible. Le remplacement génère des séquences répétées. L’expression d’I-SceI est ensuite induite par ajout de galactose, générant une coupure double-brin au site cible. Par recombinaison homologue entre les séquences répétées, la cassette de mutagenèse est excisée et donne une délétion du gène cible sans trace (Figure 11), (Noskov et al., 2010). La méthode TREC-IN (« TREC-assisted gene knock-in ») est basée sur le même principe. Un gène est inséré après les 50 bases homologues du gène cible sans trace (Figure 11), (Chandran et al., 2014).

La méthode CRISPR a été développée pour modifier les génomes clonés suite aux travaux de modifications du génome de levure par la technologie CRISPR/Cas9 (DiCarlo et al., 2013) voir section 3.2, Les systèmes CRISPR/Cas). Les différents partenaires, un plasmide codant la Cas9, un plasmide portant l’ARN guide et un substrat de recombinaison homologue, sont introduits pour cibler spécifiquement le génome de mycoplasme cloné. Cette approche a été développée chez M. mycoides subsp. capri GM12, en créant une délétion sans trace, en une seule étape, du gène glpO, codant l’oxidase glycerol-3-phosphate (Tsarmpopoulos et al., 2016). Enfin, pour obtenir un mycoplasme génétiquement modifié par approche BS, après clonage et modification du génome bactérien dans la levure, il est nécessaire d’effectuer une transplantation. La transplantation de génome est une étape limitante, consistant à extraire un génome bactérien entier et à l’introduire dans une cellule dite receveuse, résultant en une nouvelle cellule avec le génotype et le phénotype du génome donneur. Le génome donneur est marqué grâce à une cassette de résistance permettant de sélectionner les mutants possédant ce génome et permettant d’éliminer les cellules avec le génome de la cellule receveuse.

La première transplantation de génome a été effectuée au JCVI ; le génome entier de

56 transformation au PEG (Lartigue et al., 2007), résultant en une cellule n’ayant plus aucune trace du génome receveur. Le séquençage du génome transplanté a permis de conclure qu’il n’y a pas eu d’évènements de recombinaison entre les deux génomes, démontrant un changement propre d’un génome d’une cellule donneuse à une cellule receveuse. Cette technique a permis d’ouvrir la voie dans l’insertion de grands fragments d’ADN chez les mycoplasmes et notamment des génomes modifiés. Ainsi, le génome de M. mycoides cloné puis modifié dans la levure a été transplanté dans M. capricolum (Lartigue et al., 2009), et a permis d’obtenir le premier mycoplasme génétiquement modifié par des outils de BS (Lartigue et al., 2009). Cette étape de transplantation a permis de développer des mycoplasmes possédant un génome synthétique réduit, se rapprochant du concept de cellule minimale (Voir Section 2.3, Concept de cellule minimale (Gibson et al., 2010; Hutchison et al., 2016)).

Cette étape de transplantation de génome a longtemps été limitée à deux bactéries très proches qui sont M. mycoides subsp. capri et M. capricolum subsp. capricolum (Lartigue et al., 2014; Kannan et al., 2016; Schieck et al., 2016; Tsarmpopoulos et al., 2016). La distance phylogénétique entre les cellules donneuses et receveuses dans cette étape de transplantation est un facteur déterminant et limitant. Son étude a permis d’étendre la transplantation à d’autres mollicutes comme M. leachii ou M. putrefaciens (Labroussaa et al., 2016). Récemment, la transplantation de génome a été mise en place chez M. florum (Baby et al., 2018a).

En résumé, depuis la première introduction d’ADN exogène chez les mollicutes dans les années 1990, d’énormes progrès ont été réalisés pour obtenir des outils génétiques chez ces bactéries particulières (Tableau 8). Des systèmes de mutagenèses aléatoire et ciblée ont été développés chez différentes espèces, mais le meilleur outil pour manipuler ces génomes semblent être l’approche faisant intervenir la BS.