Les premières études cliniques et pharmacologiques sur les extraits de V. myrtillus ont mis en évidence des propriétés intéressantes sur le système ophtalmique et vasculaire qui semblent être liées à la fraction anthocyanosidique. La plupart des études des années 60 jusqu'à 1996 ont été réalisées sur l'extrait de fruit de V. myrtillus possédant une basse concentration d'anthocyanosides et l'extrait de Myrtocyan® hautement purifié, contenant 38% d'anthocyanosides (Marazzoni et Bombardelli, 1996).
1-2-4-1 Activité ophtalmique
L'extrait de la myrtille, seul ou en association avec le P-carotène et la vitamine E, est rapporté pour améliorer l'acuité visuelle nocturne, aide à s'adapter le plus rapidement aux conditions de faible luminosité, et diminue le temps de récupération après un éblouissement luminaire. Suite à des essais cliniques réalisés sur des contrôleurs du trafic aérien, des pilotes et des conducteurs de camions, qui ont révélé le potentiel des extraits anthocyanosidiques à améliorer la vision nocturne, l'utilisation des anthocyanes a été recommandée à ce groupe de personnes actives et tous ceux qui souffrent de faible vision nocturne (Marazzoni et Bombardelli, 1996). L'extrait d'anthocyanes de la myrtille est rapporté comme ayant une action préventive contre le glaucome, et a montré une grande efficacité dans le traitement de la rétinopathie, y compris la rétinopathie diabétique (Marazzoni et Bombardelli, 1996; Pizzorno et Murray, 1987).
1-2-4-2 Action vasoprotective
Des essais cliniques ont démontré l'efficacité des extraits de myrtille dans le traitement des maladies vasculaires périphériques, c'est à dire que ces extraits ont permis la réduction de l'approvisionnement en sang des membres inférieurs de femmes enceintes souffrant d'insuffisance veineuse chronique. Et de plus, ces extraits se sont révélés utiles dans le traitement pré- et post-opératoire de la varice des veines et dans les phases aiguës d'hémorroïdes (Marazzoni et Bombardelli, 1996).
1-3 TECHNIQUES D'EXTRACTION DES ANTHOCYANES
1-3-1 L'extraction par solvant
Bien qu'il n'existe aucun protocole d'extraction qui peut être considéré de façon optimale pour tous les types d'échantillons, les méthodes les plus fréquemment utilisées pour extraire les composés phénoliques de leurs sources végétales pour des fins analytiques sont l'extraction par solvant et celle utilisant des fluides supercritiques.
La procédure la plus commune pour extraire les anthocyanes utilise des solvants tels que le methanol ou l'éthanol avec différentes proportions d'acide chlorhydrique (HC1 0.1- 1%). L'utilisation d'un solvant organique a l'avantage d'inactiver les enzymes présentes dans les tissus végétaux et de faciliter le traitement subséquent de l'extrait obtenu, car il est facilement évaporé. Néanmoins, dépendant de la nature de l'échantillon, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter de l'eau afin de réaliser une extraction complète des anthocyanes (Escribano-Baillon et Santos-Buelga, 2003). Pour une extraction des composés d'origine alimentaire, il est préférable d'utiliser l'éthanol car il est moins toxique, bien qu'il soit moins efficace dans l'extraction et plus difficile à éliminer plus tard. Des réactions d'estérification des groupements carboxyliques libres peuvent avoir lieu en présence d'éthanol, si le processus d'extraction est réalisé à haute température.
C'est le cas par exemple des malonyles conjugués des anthocyanes du maïs (de Pascual-Teresa et al, 2002).
Strack et Wray (1989) ont rapporté que pendant le procédé d'extraction et la concentration subséquente, l'acide chlorhydrique peut hydrolyser les anthocyanes fortement acylés, particulièrement celles liées à des acides aliphatiques. Pour cette raison, et afin de réaliser une meilleure extraction des anthocyanes labiles, des conditions acides plus douces comme celles obtenues avec l'acide acétique, tartrique ou citrique sont recommandées.
1-3-2 Technologie de l'extraction des anthocyanes pour les produits pharmaceutiques
La production d'extraits d'anthocyanes pour la fabrication des produits pharmaceutiques à l'échelle industrielle est conçue pour maximiser la productivité permettant d'obtenir des anthocyanes monomériques. La forte réactivité des molécules d'anthocyanes peut les dégrader ou leur faire subir des réactions pouvant détériorer leur qualité dans les formulations galéniques. Par exemple, une concentration élevée d'anthocyanes peut initier la formation des polymères inefficacement metabolises par l'organisme (Kalt et Dufour, 1997).
La première étape de ce procédé d'extraction consiste en une macération et une extraction aqueuse préliminaires de la peau et de la chaire des fruits et légumes. Ensuite les sucres libres contenus dans l'extrait obtenu sont metabolises par Saccharomyces sp. via une fermentation. L'extrait est alors clarifié et concentré, et une deuxième extraction de celui ci est effectuée avec de l'alcool acidifié. Le nouvel extrait est séché sous vide à basse température, le matériel sec résultant est ensuite écrasé, saupoudré et empaqueté. Alternativement, les anthocyanes sont stabilisées par un traitement au dioxyde de soufre (SO2) et séparées des autres composés par chromatographic non ionique. Le solvant est éliminé par evaporation pour avoir un extrait final contenant 25 % d'anthocyanes (Kalt et Dufour, 1997).
1-4 MÉTHODES D'ANALYSE DES ANTHOCYANES
1-4-1 Isolation et purification des anthocyanes
Il est difficile de séparer les différents anthocyanes d'un extrait puisque leurs squelettes carbonés de base des différentes aglycones diffèrent très peu les uns des autres. Pour cette raison, les techniques chromatographiques sont le choix par excellence, autant pour séparer les diverses fractions d'anthocyanes que pour obtenir des pigments purs qui permettront une identification et une quantification subséquentes (Escribano-Baillon et Santos-Buelga, 2003). La chromatographic en phase gazeuse (CPG) a été peu utilisée à cause de la volatilité limitée des polyphenols impliquant une étape supplémentaire de dérivation pour assurer la volatilité des composés. De plus, cette méthode nécessite une purification préalable de l'échantillon avant la dérivation. La chromatographic sur colonne et la chromatographic à contre courant ont été également utilisées pour séparer les fractions des diverses anthocyanes pour obtenir des pigments purs qui permettront une identification et une quantification subséquente. L'inconvénient de ces techniques chromatographiques énumérées ci-dessus, réside dans la difficulté de l'obtention d'anthocyanes pures en quantités suffisantes et l'exigence de longues périodes d'analyse (Hamerstone et a l , 1999).
La technique chromatographique de choix actuellement utilisée pour la purification et la séparation des anthocyanes est la chromatographic en phase liquide à haute performance (HPLC) (Harborne, 1998; Robard et Antolovich, 1997; Merken et Beecher, 2000). Celle-ci permet une séparation, une identification et une quantification simultanées sans exiger une pureté excessive des extraits. Comparativement à la CPG, elle permet une séparation rapide des échantillons. Cependant, une extraction par phase solide sur des cartouches C-18 ou Sephadex est couramment utilisée pour une purification initiale des extraits bruts d'anthocyanes avant l'analyse par HPLC. Les anthocyanes se lient fortement à ces adsorbants à travers leurs groupements hydroxyles non substitués et sont éluées en utilisant une série de solvants de polarité croissante. Étant donné la polarité des différents anthocyanes, l'analyse par HPLC en phase inverse est généralement effectuée en établissant
un gradient linéaire ou autre, entre une phase aqueuse suffisamment acidifiée et une phase organique (methanol, acétonitrile ou acétone), dont la proportion augmente continuellement au cours de l'analyse. Étant donné que chaque laboratoire de recherche a tendance à développer une méthode analytique pour des besoins spécifiques de séparation, il est impossible de décrire une seule méthode standard. L'HPLC étant une méthode largement utilisée, elle présente une meilleure sensibilité comparativement à la spectroscopic RMN à haute résolution, cependant, elle exige une préparation des échantillons avant les analyses (Kosir et Kidric, 2002).
La plupart des techniques énumérées jusqu'ici ont démontré une capacité à séparer adéquatement les anthocyanes, mais elles ont révélé une insuffisance quant à leur elucidation structurale.
1-4-2 Détection et identification des anthocyanes
Plusieurs techniques de caractérisation ont été utilisées pour obtenir des informations structurales nécessaires afin d'identifier les anthocyanes. Celles-ci incluent la spectrofluorométrie, la spectroscopic UV-visible, la spectroscopic de résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopic de résonance Raman, la spectroscopic infra rouge (IR) et la spectrométrie de masse.
1-4-2-1 La spectrofluorométrie
La malvidine 3,5- diglucosides et la peonidine émettent de la fluorescence lorsqu'elles sont illuminées par une lumière UV. Cette propriété peut être utilisée pour identifier les anthocyanes, spécialement quand on veut détecter leur présence en chromatographic sur couche mince (CCM). De plus la malvidine 3,5- diglucosides (malvine) à travers l'oxydation et un ajustement subséquent du pH dans des conditions alcalines, conduit à la formation de dérivés fluorescents. Cette propriété peut être utilisée pour détecter leur présence et de les quantifier. Bien que cette méthode soit qualitativement
efficace, elle ne permet pas d'obtenir résultats quantitativement fiables à cause des interférences dans la matrice de la réaction de fluorescence (Rivas-Gonzalo, 2003).
1-4-2-2 La spectroscopic UV Visible
Les propriétés spectrales UV-Visibles sont souvent très utiles pour la caractérisation des anthocyanes, spécialement pour identifier le type (Rivas-Gonzalo, 2003). Les anthocyanes présentent des maxima d'absorption dans la région du visible (510 - 528 nm, dans le cas de celles du vin) aussi bien dans la région de l'UV (270 - 280 nm). L'absorbance est due à la structure de l'hétérocycle central et la conjugaison des deux cycles aromatiques, et celle-ci est influencée par le pH et le type de solvant. Les groupements fonctionnels du cycle aromatique (cycle B) de l'ion oxonium peuvent aussi exercer une certaine influence sur l'absorbance, si bien que les anthocyanes qui possèdent deux groupements fonctionnels sur ce cycle (la cyanidine et la peonidine) possèdent des maxima d'absorption de 11 nm plus bas que celles avec trois groupements fonctionnels (la delphinidine, la petunidine et la malvidine). Ces différences demeurent identiques pour les aglycones et pour les mono- et di-glucosides. La substitution des groupements hydroxyles par des groupements méthoxyles sur le cycle B provoque un déplacement de l'absorption vers des longueurs d'onde plus courtes (effet hypsochrome), apportant ainsi une grande stabilité à la molécule. L'absorbance des anthocyanidines à l'exception de celle de la malvidine et la peonidine, peut subir aussi un déplacement de l'absorption vers des longueurs d'onde plus grandes (effet bathochrome) en présence de AICI3, une propriété caractéristique qui a souvent été utilisée comme critère de différenciation entre les différentes anthocyanes (Rivas-Gonzalo, 2003).
1-4-2-3 La résonance magnétique nucléaire (RMN)
Cette technique a été utilisée pour l'identification des anthocyanes, et elle a assurément permis une identification correcte. Néanmoins, la complexité des ces composés doit être prise en compte, due, avant tout, à la présence des sucres dans la molécule, ce qui
nécessite l'utilisation d'instruments capables de fournir une résolution suffisante afin d'avoir une bonne distribution des signaux des carbones et des protons dans le spectre RMN. D'un autre coté, il est nécessaire d'utiliser des milieux tels que le chlorure de deuterium (DC1) ou le CF3COOD, dans le but de déplacer les équilibres qui permettent d'avoir seulement des cations flavylium dans la solution, sinon il pourrait s'avérer compliqué d'obtenir un spectre à cause de la coexistence de plusieurs formes chimiques. L'utilisation de la spectroscopic RMN à une dimension (ID), à deux dimensions (2D) du *H et du 13C avec des méthodes de signaux larges permet d'avoir des distributions fiables des signaux de résonance *H et 13C pour les anthocyanes individuels dans le CD3OD qui serviront d'outil pour une identification particulière en analyse HPLC (Kosir et Kidric, 2002). Contrairement à l'HPLC, la préparation des échantillons est plus simple et moins longue en spectroscopic RMN. Un autre grand avantage de la RMN à haute résolution est la possibilité de détecter la résonance magnétique des différents noyaux présents dans une molécule dans différents environnements électroniques et spatiaux (Kosir et Kidric, 2002). A part les inconvénients déjà mentionnés, cette technique exige de grandes quantités de produit qui permettent d'obtenir des spectres suffisamment perceptibles par rapport aux bruits de fond, représantant un sérieux handicap dans l'identification des anthocyanes. De plus, il est nécessaire de travailler avec des composés purs, ce qui implique une isolation initiale très précise.
1-4-2-4 La spectroscopic de résonance RAMAN
C'est une technique qui utilise un rayon laser comme source de lumière. Lorsque celle-ci est absorbée par un échantillon, elle est essentiellement dispersée sans changement de la fréquence. Cependant une petite portion des protons incidents en diffusion, subit un changement de fréquence. La dispersion Raman qui est caractéristique de l'échantillon ne dépend pas de la fréquence d'excitation. Comme cette technique exige des concentrations très élevées d'anthocyanes et que le spectre obtenu doit correspondre à toutes les molécules présentes dans l'échantillon, son utilisation est donc limitée (Rivas-Gonzalo, 2003).
1-4-2-5 La spectroscopic infrarouge (IR)
Comparativement aux autres techniques spectroscopiques, la spectroscopic infrarouge (IR) est la seule à être limitée pour donner des informations utiles pour l'élucidation structurale des anthocyanes et de ce fait elle a été supplantée. Bien qu'une tentative ait été faite pour réaliser une étude systématique dans ce secteur concernant l'investigation des principaux anthocyanes, les résultats obtenus tendent à montrer que cette technique est peu concluante pour identifier les structures des anthocyanes. Ce desavantage est inhérent à la difficulté de l'interprétation de la technique (Ribéreau-Gayon, 1972). Les spectres IR des glycosides peuvent être utilisés comme données de référence pour des motifs de comparaison, mais la détermination structurale des anthocyanes complexes ne serait pas possible avec cette méthode.
1-4-2-6 La spectrométrie de masse (MS)
La spectrométrie de masse est une technique qui permet l'identification des anthocyanes par la détermination de la masse des ions moléculaires dans l'échantillon et l'identification des fragments provenant de la rupture des composés à travers l'application d'une haute énergie d'ionisation. L'étude de la fragmentation des anthocyanes accentue le fait qu'elles ont une répétition des modèles de fragmentation. L'identification de ces modèles peut s'avérer utile pour identifier les composés originaux. Récemment, l'introduction de la technique de bombardement rapide d'atomes-spectrométrie de masse (FAB-MS) (Strack et Wray, 1989) et l'ionisation par jet d'électrons-spectroscopie de masse (ESI-MS) (Baldi et al, 1995) ont permis une grande avancée dans l'identification structurale des composés chimiques, spécialement dans l'analyse des anthocyanes de différentes origines botaniques. La technique FAB-MS a été particulièrement utile pour la caractérisation des composés dans le cas où la RMN rencontre des difficultés. Par exemple pour le malonyle et l'oxalyle d'anthocyanes, elle a fourni des informations adéquates provenant de la fragmentation.
1-4-3 Les techniques couplées
Le couplage des techniques spectroscopiques moléculaires mentionnées ci dessus avec les techniques chromatographiques telles que l'HPLC et celui de l'HPLC avec la technique 'Diode Array Detection' (DAD) constituent les meilleures méthodes d'analyse qualitative et quantitative des anthocyanes. Il est difficile de fournir une définition adéquate des techniques couplées qui seraient valides dans toutes les situations.
1-4-3-1 HPLC- MS
La caractérisation des mélanges d'anthocyanes implique habituellement la séparation, la collection de chaque composé et des analyses subséquentes. Le manque de standards adaptés nécessite une longue et fastidieuse procédure pour l'identification des composés -inconnus. L'HLPC-MS combine la séparation par HPLC avec la sélectivité et la sensibilité
d'un détecteur spectrométrie de masse (MS) permettant l'identification des composantes individuelles d'un mélange des substances. Les anthocyanes sont séparées dans une colonne HPLC à phase inversée ou normale de calibre étroit avec un gradient d'élution utilisant l'acétonitrile, l'eau et l'acide acétique. Généralement, un spectromètre de masse à triple quadrupoles est utilisé. À titre d'exemple, plusieurs dérivés de la cyanidine ont été identifiés y compris les cyanidines acylées et non acylées. Les nouvelles méthodes d'ionisation à pression atmosphérique : l'ionisation par jet d'électrons (ESI) et l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) qui permettent la soumission à l'analyse spectrométrique de masse, se sont avérées appropriées pour le couplage avec l'HPLC (Baldi et al, 1995; Gaskel, 1997). Baldi et al. (1995) ont utilisé l'HPLC-MS avec une interface d'ionisation à jets d'électrons à pression atmosphérique pour analyser les anthocyanes contenues dans les pelures de raisin. Un extrait de pelures de raisins traitées avec de l'éthanol acidifié a été fractionné avec des solvants organiques pour obtenir un échantillon contenant seulement des anthocyanes. Dix neuf dérivés de cyanidine, de delphinidine, de petunidine, de malvidine et de peonidine ont été identifiés par cette technique d'ionisation. Les spectres de masse individuels ont révélé des pics
correspondants à l'ion moléculaire et à l'ion fragment de l'aglycone. Lorsque les anthocyanes sont estérifées, un fragment additionnel est détecté à des valeurs m/z coïncidant à la perte des groupements acyles de l'ion moléculaire.
1-4-3-2 HPLC-Diode Array Detection (DAD)
L'introduction dans les années 80 du spectrophotomètre de detection à faiseaux d'iode ou 'Diode Array Detection' (DAD) associé à l'HPLC (HPLC-DAD) a ouvert de nouvelles perspectives qui ont permis d'importants perfectionnements dans la séparation, l'identification et la quantification des anthocyanes. Ceci a permis l'acquisition de spectres UV-Visibles en ligne durant les analyses chromatographiques, c'est-à-dire que les caractéristiques de rétention et les spectres UV-Visibles peuvent être utilisés à ces fins. En HPLC-DAD l'éluant chromatographique est scanné pour avoir des données spectrales UV- visibles qui sont sauvegardées et qui peuvent être comparées plus tard à une librairie de référence pour l'identification des pics. Ce type de détecteur permet un enregistrement simultané des chromatogrammes à différentes longueurs d'ondes facilitant ainsi une détection sélective des différentes anthocyanes aux longueurs d'ondes auxquelles elles présentent un maximum d'absorption. Ce qui permet d'améliorer les possibilités de quantification. La sensibilité peut être améliorée par une sélection adéquate de la longueur d'onde pouvant permettre la quantification d'un composé même si la résolution est faible.
1-4-3-3 HPLC-DAD-MS
L'application de HPLC-DAD-MS utilisant l'ionisation par jet d'électrons (ESI) a facilité l'identification des anthocyanes de plusieurs échantillons de végétaux comme par exemple la carotte noire, le raisin, la fraise, l'épis de maïs (de Pascual-Teresa et al, 2002) et le vin rouge (Vivar-Quintana et a l , 2002 ; Mateus et al, 2002).
1-4-4 Méthodes d'analyse du potentiel antioxydant des anthocyanes
1-4-4-1 Les radicaux libres et les antioxydants
Un radical libre est une molécule dont un ou plusieurs de ces électrons sont célibataires sur l'orbitale externe d'un ou plusieurs de ses atomes. Ces électrons instables rendent les radicaux libres fortement réactifs capables d'induire des réactions d'oxydation sur les lipides, les protéines, l'ADN et les hydrates de carbone (Nuttall et al, 1999). Dans les circonstances normales, il existe un grand nombre d'antioxydants, synthétisés par l'organisme (superoxyde dismutase, catalase, glutathion peroxydase) ou apportés par l'alimentation (anthocyanes, P-carotène, vitamine C, vitamine E) formant ainsi une défense normale contre les espèces réactives de l'oxygène pour neutraliser leurs effets résultant en des radicaux beaucoup moins réactifs. Le déséquilibre entre les antioxydants protecteurs et les radicaux libres en faveur des ces derniers serait à l'origine des pathologies liées au stress oxydatif (Nuttall et al, 1999).
Il existe peu d'études dans la littérature sur la caractérisation de la capacité antioxydante des composés phénoliques des fruits et légumes. Selon la littérature, Cao et a l , (1996) et Wang et a l , (1996) ont réalisé les premières mesures pour quantifier le potentiel des antioxydants de source végétale. La capacité antioxydante est définie comme le potentiel d'une substance à neutraliser ou à inactiver les radicaux libres dans des conditions oxydantes défavorables. Il existe plusieurs méthodes permettant d'évaluer la capacité antioxydante des substances. Les méthodes les plus couramment rapportées dans la littérature sont l'ORAC (Oxygène Radical Absorbance Capacity) (Cao et al, 1995), le FRAP (Ferrie Reducing Ability of Plasma) (Benzie et al, 1996) et le TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity) (Miller et al, 1993; Berg et al, 1999).
1-4-4-2 Capacité d'absorption des radicaux oxygènes (ORAC)
L'analyse ORAC développée par Cao et al. (1993, 1995) est une méthode chimique qui permet d'évaluer le potentiel antioxydant des composés chimiques variés et d'échantillons biologiques. L'analyse ORAC a été utilisée par plusieurs laboratoires et a fourni des informations substantielles concernant la capacité antioxydante de divers échantillons provenant des composés purs tels que les flavonoïdes, les matrices complexes telles que le thé (Cao et al, 1996), les fruits (Wang et al., 1996) et les légumes (Cao et al., 1996). La méthode ORAC est basée en grande partie sur les travaux de Glazer (1990) qui ont montré que la perte de fluorescence de la p -phycoerythrine (P-PE), une protéine isolée de Porphyridium cruentum, en présence d'un générateur de radicaux peroxyles comme la 2,2'-azo-6/.s (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) sert de molécule indicatrice mesurant l'ampleur des dommages causés par les radicaux libres. L'effet protecteur d'un antioxydant est mesuré en évaluant la protection qu'il procure contre la perte de fluorescence de la P-PE. Cette méthode est connue sous le nom de ORACPE.
Les résultats sont exprimés en unité ORAC. Cette unité ORAC représente la protection nette que procure 1 uM Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetraméthylechromane-2-acide carboxylique [Trolox : un analogue hydrosoluble de la vitamine E]). L'ORAC a été automatisé pour l'usage avec un analyseur centrifuge spectrofluométrique (COB AS F ARA II) (Cao et al, 1995). L'ORACPE est très sensible et permet d'évaluer les étapes initiales du
processus d'oxydation. Néanmoins cette technique est longue et onéreuse (Fogliano et al,