Le premier domaine d’application en biophotonique des recherches exposées ci-dessus porte sur l’amélioration et l’extension des techniques de spectroscopie par corrélation de fluorescence (figure 4.1). Grâce aux faibles volumes mis en œuvre, l’analyse de réactions de clivage enzymatique d’ADN peuvent être conduites à de très fortes concentrations de plusieurs dizaines de micromolaires, alors que les mesures standard sont limitées à des concentrations dans la gamme de 10-100 nanomolaires. De plus, le bruit lié à la diffusion éalstique et inélastique dans le volume d’analyse est réduit.
Fig. 4.1. Applications biophotoniques et nanophotoniques de nano-ouvertures individuelles.
Trois articles de revues ont été publiés concernant les applications en biologie et biochimie des structures nanophotoniques. Le premier traite de l’analyse de fluorescence dans des nano-ouvertures métalliques 1. Le second porte plus généralement sur les applications biophotoniques des
1 P.-F. Lenne, et al, Fluorescence fluctuations analysis in nanoapertures: physical concepts and biological applications, HistoChem. Cell. Biol. 130, 795-805 (2008)
Chapitre 4 Quelques applications en biophotonique
ouvertures (individuelles ou en réseau) 2. Le troisième décrit les principaux systèmes nanophotoniques pour la détection exaltée de molécules fluorescentes en solution 3.
L’exaltation électomagnétique de la fluorescence améliore également le rapport signal à bruit pour le suivi de réactions moléculaires. En FCS, le rapport signal à bruit est proportionnel au taux de comptage de fluorescence par molécule, et à la racine carrée du temps total d’intégration. Ainsi, un gain de 10 sur la fluorescence par molécule se traduit par une augmentation de 10 du rapport signal à bruit, ou de manière équivalente, à la possibilité de réduire d’un facteur 10² = 100 le temps total d’intégration. Ceci est particulièrement bénéfique pour le suivi rapide de réactions enzymatiques à forte concentration. Nous avons démontré expérimentalement ces principes dans l’étude 4 (article Analytical Chemistry ci-après), où le clivage de double brins d’ADN a été suivi à des concentrations micromolaires avec une résolution de la seconde (figure 4.2). Jusqu’alors, l’état de l’art de la FCS fonctionnait pour des concentrations nanomolaires et des résolutions temporelles de l’ordre de la minute. Les fortes exaltations du signal par molécule dans le cas des nano-ouvertures ou des microsphères ouvrent des nouvelles approches pour l’analyse rapide d’un grand nombre de réactions biochimiques.
Fig. 4.2. L’exaltation et le confinement dans le cas d’une nano-ouverture permettent le suivi rapide d’une réaction de clivage de double brins d’ADN par une enzyme EcoRI à forte concentration.
2 J. Wenger, et al, Biophotonics applications of nanometric apertures, Int. J. Materials and Product Technology 34, 488-506 (2009)
3 J. Wenger, H. Rigneault, Photonic Methods to Enhance Fluorescence Correlation Spectroscopy and Single Molecule Fluorescence Detection, Int. J. Mol. Sci. 11, 206-221 (2010)
4 J. Wenger, et al, Nanoaperture-Enhanced Signal-to-Noise Ratio in Fluorescence Correlation Spectroscopy, Anal. Chem. 81, 834-839 (2009).
Chapitre 4
Un autre domaine important d’application de l’analyse de molécules fluorescentes concerne l’étude des fonctions biologiques des cellules. La compréhension de l'architecture fine de membra cellulaires nécessite le développement de nouvelles méthodes d'investigation pour dépasser les limites de résolution et de sensibilité imposées par le phénomène de diffraction. Nous avons utilisé des ouvertures nanométriques isolées dans des films méta
en microscopie optique sous la limite de diffraction d'un champ propagatif. En agissant comme un trou de filtrage placé directement dans le plan objet, la nanoouverture autorise une observation d’une zone sous la limite de diffraction optique
Fig. 13 Principe de l’utilisation d’une nano fluorescentes dans la membrane cellulaire.
Cette ultra-résolution est mise à profit pour étudier la diffusion latérale de marqueurs individuels dans des membranes biologiques de cellules vivantes
comparaison des comportements pour différentes espèces ré
dimensions nanométriques qui contraignent la diffusion membranaire. On voit par exemple dans la
5 J. Wenger, et al, Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization, Biophys. J. 92, 913-919 (2007).
4 Quelques applications en biophotonique
Un autre domaine important d’application de l’analyse de molécules fluorescentes concerne l’étude des fonctions biologiques des cellules. La compréhension de l'architecture fine de membra cellulaires nécessite le développement de nouvelles méthodes d'investigation pour dépasser les limites de résolution et de sensibilité imposées par le phénomène de diffraction. Nous avons utilisé des ouvertures nanométriques isolées dans des films métalliques pour réduire le volume d'observation en microscopie optique sous la limite de diffraction d'un champ propagatif. En agissant comme un trou de filtrage placé directement dans le plan objet, la nanoouverture autorise une observation d’une zone
a limite de diffraction optique (figure 4.3).
Principe de l’utilisation d’une nano-ouverture pour sonder la diffusion latérale de molécules fluorescentes dans la membrane cellulaire.
résolution est mise à profit pour étudier la diffusion latérale de marqueurs individuels dans des membranes biologiques de cellules vivantes 5 (articler Biophysical Journal ci
comparaison des comportements pour différentes espèces révèle la présence d'hétérogénéités de dimensions nanométriques qui contraignent la diffusion membranaire. On voit par exemple dans la
J. Wenger, et al, Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane 919 (2007).
Un autre domaine important d’application de l’analyse de molécules fluorescentes concerne l’étude des fonctions biologiques des cellules. La compréhension de l'architecture fine de membranes cellulaires nécessite le développement de nouvelles méthodes d'investigation pour dépasser les limites de résolution et de sensibilité imposées par le phénomène de diffraction. Nous avons utilisé lliques pour réduire le volume d'observation en microscopie optique sous la limite de diffraction d'un champ propagatif. En agissant comme un trou de filtrage placé directement dans le plan objet, la nanoouverture autorise une observation d’une zone
ouverture pour sonder la diffusion latérale de molécules
résolution est mise à profit pour étudier la diffusion latérale de marqueurs individuels dans (articler Biophysical Journal ci-après). La vèle la présence d'hétérogénéités de dimensions nanométriques qui contraignent la diffusion membranaire. On voit par exemple dans la
Chapitre 4 Quelques applications en biophotonique
figure 4.3 un comportement non-linéaire du temps de diffusion en fonction de la surface membranaire éclairée. Ce comportement s’explique par la présence de nanodomaines moléculaires (enrichis en lipides, cholestérol, protéines…) qui altèrent le processus de diffusion des marqueurs fluorescents. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des domaines de dimensions de l’ordre de 50 nm, bien en dessous de la limite de résolution de microscopes optiques.
Un aspect plus technologique de mes recherches porte sur le développement de systèmes simples, compacts et efficaces pour la détection et l’analyse de molécules fluorescentes, en particulier avec la méthode de corrélation temporelle FCS. Cette technique est très polyvalente, mais elle nécessite une forte sensibilité de fluorescence, pour être capable de sonder des molécules individuelles. Ceci explique que tous les dispositifs actuels emploient des objectifs de microscope de forte ouverture numérique, qui sont à la fois chers et complexes. En conséquence, la parallélisation et la portabilité de la FCS (comme de l’analyse de molécules individuelles) sont limitées.
En exploitant la focalisation introduite par la microphère, nous avons montré qu’une combinaison {microsphère+lentille de faible ouverture numérique} permet de détecter efficacement le signal de fluorescence d’une molécule individuelle, en dépit d’un système optique extrêmement simple 6. Nous avons en particulier démontré la détection d’une seule molécule fluorescente avec une lentille plastique jetable de lecteur de disque optique CDrom. Ces travaux ouvrent des perspectives d’application pour la détection exaltée de particules dans des dispositifs opto-fluidiques intégrés. En combinant la focalisation induite par une microsphère avec une fibre optique, nous avons réalisé le premier dispositif de corrélation de fluorescence en mode endoscope avec la sensibilité d’une molécule individuelle 7 (figure 4.4, article Optics Express ci-après). Ces travaux étendent le domaine d’application de la FCS aux systèmes d’endoscopie, offrant ainsi de nouvelles méthodes d’analyse (fluorescence, pH, température, agrégation moléculaire…) dans un dispositif compact et portable. Un brevet a été déposé.
6 Wenger J., et al, Disposable Microscope Objective Lenses for Fluorescence Correlation Spectroscopy Using Latex Microspheres, Anal. Chem. 80, 6800-6804 (2008).
7 H. Aouani, et al, Optical-fiber-microsphere for remote fluorescence correlation spectroscopy, Opt. Express 17, 18912-18919 (2009).
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Fig. 14. Plus petit dispositif de spectroscopie FCS, et premier système assurant une sensibilité à la molécule individuelle. La fibre optique microstructurée remplace l’objectif de microscope.