La technique de la PCR en temps réel
4. Les appareils de la PCR en temps réel
Figure 14. Représentation schématique du principe de la méthode sondes Scorpions5. (a) Durant l’étape de dénaturation, la balise moléculaire est sous forme relaxée et libre en solution mais la
proximité des fluorochromes permet l’inhibition de la fluorescence. (b) L’amorce scorpion se fixe à sa séquence complémentaire cible. (c) Polymérisation du brin complémentaire.
(d) Dénaturation des brins d’ADN.
(e) Hybridation de la séquence complémentaire de la partie balise moléculaire à sa séquence cible permettant l’émission de fluorescence.
4. Les appareils de la PCR en temps réel
Un appareil de PCR en temps réel est un thermocycleur couplé à un
spectrofluorimètre (système optique de détection de la fluorescence générée lors des
réactions de PCR en temps réel) 44.
Tous les systèmes actuellement commercialisés combinent le thermocycleur et le module de détection fluorimétrique pilotés par une station de travail informatique permettant l’acquisition de la fluorescence émise et le traitement des données obtenues et ils peuvent être classés en deux catégories :
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Les systèmes haut débit qui permettent le suivi simultané d’au moins 96 réactions PCR sont les systèmes ABI PrismTM 7000, 7700 et 7900 (Applied Biosystems), l’iCyclerTM (Bio-Rad), le MX-4000TM (Stratagene) et le DNA Engine OpticonTM (MJ Research).
ABI Prism 7900 HT fast real time PCR(Applied Biosystems) 45 . Icyclertm (Bio-Rad) 46 .
MX-4000TM (Stratagene) 47. DNA Engine OpticonTM (MJ Research) 48 .
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Les systèmes Light CyclerTM (Roche Diagnostics), Smart CyclerTM (Eurogentec) et Rotor-GeneTM (Corbett Research) sont des systèmes à moindre débit mais de plus grande flexibilité. 28
Light CyclerTM (Roche Diagnostics) 49.
Smart CyclerTM (Eurogentec) 50. Rotor-GeneTM (Corbett Research) 51.
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4.1 Les thermocycleurs
Tous les systèmes haut débit précédemment cités (à l’exception de l’ABI PrismTM 7700 qui fonctionne avec un thermocycleur combinant une résistance électrique comme système de chauffage et un groupe froid comme système de refroidissement) utilisent un thermocycleur 96 puits muni d’un module thermoélectrique à effet Peltier et d’un couvercle chauffant contribuant à limiter la formation de gradients de température au sein des tubes tout en rendant inutile l’adjonction d’huile minérale 28.
Afin de compenser les incohérences de température liées à un effet de gradient de température entre le centre et les bords du bloc thermique (ou « effet bord »), ce dernier peut être équipé de bords chauffants (cas de l’ABI PrismTM 7000) ou d’un couvercle chauffant à gradient de température (cas du MX-4000TM) 28.
Par ailleurs, l’association d’un effet Joule à l’effet Peltier a permis d’obtenir une meilleure homogénéité de la température au sein du bloc thermique, d’atteindre des variations thermiques plus rapides que celles obtenues par simple effet Peltier (vitesses de chauffage et de refroidissement de l’ordre de 2 à 3°C par seconde au lieu d’1°C par seconde) et ainsi de raccourcir la durée des cycles de température (soit 40 cycles réalisés en environ 90 minutes au lieu de 120 minutes) 28.
Le support des échantillons est pour ces systèmes la microplaque, ce qui permet de réaliser de 96 à 384 PCR simultanément et ce qui rend possible l’automatisation de l’étape de pré-PCR au moyen de stations de pipetage. Ce sont par exemples les cas du thermocycleur m2000rt avec une extraction sur les automates m2000sp ou m1000 (Abbott) ou du thermocycleur COBAS TaqMan associé au COBAS AmpliPrep (Roche Diagnostics) 52.
Le Light CyclerTM et le Rotor-GeneTM ont un thermocycleur à air pulsé. L’air ambiant insufflé dans une enceinte hermétique est chauffé au moyen d’une résistance électrique puis homogénéisé par un ventilateur (cas du Light CyclerTM) ou par la force centrifuge d’un rotor animé d’une certaine vitesse (cas du Rotor-GeneTM). L’air chaud est ensuite refroidi par une nouvelle insufflation d’air ambiant 28.
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Comparé aux thermocycleurs à effet Peltier, les thermocycleurs à air pulsé assurent une répartition plus homogène de la température d’un échantillon à un autre, l’homogénéité de la température étant un critère très important allant conditionner la précision et la reproductibilité des mesures effectuées 28.
Le Light CyclerTM présente la particularité d’utiliser un carrousel piloté par un moteur pas-à-pas qui porte 32 capillaires en verre dans lesquels vont se dérouler les réactions PCR. Les capillaires étant en verre, de faible section et totalement immergés dans l’enceinte thermorégulée, les transferts thermiques sont extrêmement rapides et les vitesses de montée et descente en température également rapides, pouvant atteindre jusqu’à 20 °C par seconde. Les cycles sont très courts et la durée d’amplification peut être réduite à 30 minutes pour 40 cycles.
Dans le Rotor-GeneTM, l’action combinée de la force centrifuge exercée par le rotor (36 ou 72 puits) en mouvement (500 tours/minute pour les montées en température et 1 000 tours/minute pour les descentes) et de l’air pulsé sur la résistance électrique permet de maintenir une uniformité de température largement supérieure à celle obtenue dans les autres thermocycleurs (± 0,01 °C entre les puits).
Le Smart CyclerTM est un système constitué de 16 modules iCoreTM (intelligent cooling heating optical reaction) comprenant chacun un thermocycleur miniaturisé, un microspectrofluorimètre et un système micro-informatique d’analyse de données. Le thermocycleur est équipé d’un ventilateur et de plaques chauffantes en céramique hautement conductrices de chaleur et munies de capteurs thermiques. Le système permet d’obtenir des variations thermiques très rapides, de l’ordre de 10 °C par seconde pour les montées en température et de 2,5 °C par seconde pour les descentes. Chaque module iCoreTM étant indépendamment programmable, il est possible de réaliser simultanément 16 réactions PCR différentes. Six blocs de 16 modules peuvent être montés en parallèle et permettre la réalisation de 96 PCR 28.
À la différence des systèmes ABI PrismTM, Light CyclerTM, MX 4000TM, Smart CyclerTM et Rotor-GeneTM qui incluent dans un même ensemble le thermocycleur et le module de détection fluorimétrique (systèmes compacts), l’iCyclerTM et le DNA Engine
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OpticonTM sont des systèmes modulaires comprenant un thermocycleur auquel peut être adapté un bloc optique optionnel pour la PCR quantitative en temps réel 28.
4.2 Le module de détection fluorimétrique
Il est composé d’une source lumineuse d’excitation et d’un système de détection allant capter les signaux de fluorescence émise.
Les sources lumineuses d’excitation employées sont de trois types :
Source laser-argon ; Lampe électronique LED (light emitting diode) et Lampe halogène à filament de tungstène.
Les sources laser et LED produisent un faisceau lumineux très intense qui est ensuite généralement filtré à l’aide d’un filtre à bande passante étroite, ce qui limite le choix des fluorophores utilisables.
Les lampes halogène ont un domaine spectral étendu, ce qui permet, grâce à des filtres optiques optimisés pour éviter le chevauchement des spectres d’excitation, d’utiliser un très grand nombre de fluorophores différents. Elles produisent une intensité lumineuse plus faible que les sources laser et les LED, elles sont donc moins sensibles, inconvénient compensé par un bruit de fond moindre.
Les systèmes de détection peuvent être :
Une caméra CCD (charge coupled device), une barrette de photodiodes ou des tubes photomultiplicateurs.
Ces derniers ont une sensibilité supérieure aux caméras CCD et aux photodiodes, ce qui les rendrait particulièrement bien adaptés dans une PCR multiplex à la détection simultanée des signaux émis par plusieurs fluorophores.
Le plupart des systèmes sont multicanaux et permettent donc de réaliser des PCR multiplex. On peut considérer que l'existence de deux canaux est un minimum car cela permet la détection d'un contrôle interne simultanément de Ia cible (exemples : MiniOpticon et Opticon2, thermocycleurs à plaques de 48 et 96 échantillons proposés dans la gamme Bio-Rad) 52.
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4.3 La station de travail informatique
Tous les systèmes ouverts présentés permettent d’acquérir en temps réel et d’afficher les données mesurées. Les courbes d’amplification peuvent être suivies en direct. De nombreux systèmes proposent une traçabilité des utilisateurs avec des droits d’accès variables.
Certains, particulièrement orientés vers le diagnostic clinique, possèdent un module d’interprétation automatique des séries avec validation des principales données et paramétrable ou non selon les systèmes par l’opérateur.
Tous les systèmes supportent l’exportation des données permettant par exemples le suivi à distance du bon déroulement de la réaction et l’interrogation à distance d’un ingénieur d’application en cas de difficulté 52.
4.4 Comparaison technique des différents systèmes de la PCR
quantitative
Tableau VII. Comparaison des caractéristiques techniques des différents systèmes de la PCRq (1) 28.
Systèmes
ABI Prism Light
Cycler MX-4000 I-Cycler
7700 7900 7000
Fabricant Applied Biosystems Roche Stratagene Bio-Rade
Thermocycleurs
Type Effet joule+ Groupe froid
Effet Peltier Effet Peltier
Air pulsé Effet Peltier+ Effet joules Effet Peltier+ Effet joules Précision température ±0.25°C ±0.25°C ±0.1°C ±0.3°C ____ ±0.3°C Uniformité Température ±0.5°C ±0.5°C ±0.5°C ±0.1°C ±0.25°C ±0.4°C Rampes
Température 1°C/sec 1°C/sec 5°C/sec 20°C/sec 2°C/sec 3°C/sec
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40cycles/120min 40cycles/120min 40cycles/75min 40cycles/30min 40cycles/90min 40cycles/90min Capacité 96 tubes 96-384 tubes 96 tubes 32 capillaires 96 tubes 96-384 tubes