La technique de la PCR en temps réel
2. Amplification exponentielle et quantification
2. Amplification exponentielle et quantification
2.1 Amplification exponentielle
Nature exponentielle de la réaction PCR
La PCR est par définition une réaction en chaîne au cours de laquelle les produits issus d’un cycle d’amplification servent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui s’établit par la répétition des cycles de dénaturation-hybridation-élongation aboutit à une accumulation exponentielle théorique de 2n fois par molécule d’ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d’amplification suivant la relation mathématique suivante : N=N 0.2 n (où : N est le nombre de molécules amplifiées au final, N0
le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d’amplification) 28.
Efficacité d’amplification
Au niveau expérimental, la quantité de produit formé dépend d’un facteur primordial qui est l’efficacité d’amplification (E) définie comme étant la proportion moyenne des molécules d’ADN cible se dupliquant à chaque cycle d’amplification.
L’efficacité d’amplification est comprise entre 0 (aucune amplification ne s’est produite) et 1 (après chaque cycle PCR, chaque molécule d’ADN cible a généré deux amplicons).
Dans les conditions expérimentales habituelles, E est inférieur à 1 et varie entre 0,78 et 0,97 selon le gène amplifié.
L’introduction de ce facteur essentiel, qu’est l’efficacité d’amplification, dans le calcul du nombre de molécules amplifiées après n cycles d’amplification conduit à l’équation suivante :
N=N0. (1 + E) n Convertie sous forme logarithmique, cette équation a pour expression : Log N = Log N0 + n. Log (1 + E)
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La représentation graphique des variations du logarithme du nombre N de molécules amplifiées (Log N) en fonction du nombre de cycles d’amplification(n) est une droite dont la pente est Log (1 + E) et l’ordonnée à l’origine le nombre initial de molécules(N0).
Il est alors possible de calculer E : E = 10– 1/pente puis d’en déduire le nombre initial de molécules N0.
De nombreux facteurs expérimentaux (concentrations en désoxynucléoside triphosphate (dNTP), en MgCl2 et en ADN polymérase, température, structure secondaire et contenu en bases G/C de la séquence cible, longueur du fragment à amplifier, présence d’inhibiteurs de l’ADN polymérase ou de la transcriptase inverse) peuvent affecter l’efficacité d’amplification 28.
Phase plateau de la réaction PCR
L’accumulation exponentielle de la quantité de produits au cours de la réaction PCR n’est, en réalité, observée que pendant les 20 à 35 premiers cycles.
Au cours des derniers cycles d’amplification, l’accumulation se ralentit et la quantité de produits formés tend vers une limite ; C’est l’effet plateau (ou saturation).
La phase plateau reflète une baisse de l’efficacité d’amplification qui résulte en partie de l’inactivation thermique partielle de l’ADN polymérase au cours des derniers cycles et du fait que les produits nécessaires à l’amplification (notamment dNTP et amorces) deviennent limitants.
D’autres phénomènes sont également impliqués : réhybridation préférentielle de la cible avec elle-même plutôt qu’avec les amorces, activation de l’activité 5’-3’ exonucléase de l’ADN polymérase et probablement accumulation de pyrophosphates résultant de la dénaturation thermique des dNTP et inhibiteurs de l’activité polymérase 28.
2.2 Quantification
Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification
Le principe de la PCR quantitative en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable
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d’émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR.
L’intensité de la fluorescence émise par la molécule reporter augmente à chaque cycle PCR. Par ce suivi, il est alors possible de tracer une courbe, de caractériser les différentes phases de la cinétique PCR et de mesurer la quantité de produit d’amplification généré en un point de la phase exponentielle (figure8).
C’est uniquement au cours de cette phase qu’il sera possible d’extrapoler la quantité de matrice cible initialement présente avant amplification. Au cours des premiers cycles d’amplification, l’intensité de la fluorescence émise est très faible et va permettre de définir la ligne de base de la courbe. Après un certain nombre de cycles, l’accumulation des produits de PCR entraîne une variation mesurable de l’intensité de la fluorescence émise.
Le point de départ de la phase exponentielle, phase au cours de laquelle l’efficacité d’amplification est supposée rester constante, est appelé cycle seuil optique (figure8).
Plus précisément, le cycle seuil optique est le nombre fractionnaire de cycles pour lequel l’intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur seuil (ou seuil de détection optique) significativement différente du bruit de fond. Selon l’algorithme utilisé pour son calcul, il est symbolisé par les lettres Ct (Threshold cycle) ou Cp (crossing point).
Le cycle seuil est un point remarquable de la cinétique d’amplification car il se trouve inversement proportionnel au logarithme du nombre N0 de molécules d’acide nucléique cible initialement présentes avant amplification par PCR 28.
Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré 30 et plus la quantité d’ADN diminue plus le Ct augmente.
Donc le Ct est inversement proportionnel au nombre de copies d’ADN initiales à amplifier, d’où l’aspect quantitatif de la PCR en temps réel 31.
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Figure 8. Le suivi en temps réel d’une réaction PCR 28.
La cinétique de la réaction PCR met en jeu en trois phases :
Une phase d’initiation, une phase exponentielle et une phase plateau.
Elle est construite à partir de plusieurs points d’amplification ; Un point d’amplification est un point présentant pour coordonnées le nombre de cycles PCR versus l’intensité de fluorescence émise.
La ligne de base reflète l’intensité du bruit de fond de fluorescence.
La ligne seuil correspond au seuil de détection optique au-delà duquel la variation en intensité de fluorescence suit une loi exponentielle.
Le point d’intersection de la courbe cinétique PCR avec la ligne seuil définit le cycle seuil Ct qui est le point de départ de la phase exponentielle et qui se trouve directement lié à la quantité de cible initialement présente dans l’échantillon 28.
Les Types de quantification
La quantification absolue
-Détermine une quantité initiale d’un acide nucléique cible. -Requiert une courbe standard 32.
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La quantification relative
-Détermine la différence (en nombre de fois) d’une quantité initiale d’acides nucléiques entre les différents échantillons
-Performée avec ou sans courbe standard
-Utilisée pour l’analyse de l’expression de gènes avec un gène cible normalisé par un gène de référence 32.
-Les gènes les plus souvent utilisés comme référence sont des gènes dits «de ménage» tels que l’ARN 16S bactérien, rpoB (codant la sous unité ß de l’ARN polymérase), gapdh (codant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), gst (codant la glutathion –S-transférase) ou le gène codant l’actine des eucaryotes…33.
Les considérations en quantification relative
L’expression des gènes de référence doit être constante entre les différents échantillons et efficacité de réaction de la cible et de la référence doivent être calculée ; la méthode qui requiert une validation 32.
1) Avec courbe standard
Les quantités utilisées pour mesurer la différence (en nombre de fois) d’un acide nucléique cible et d’un acide nucléique de référence, et le ratio du gène cible sur gène de référence utilisé pour normaliser
2) Avec la méthode comparative de Livak (2-ΔΔCt ou Cp)
Le Ct ou Cp est utilisé pour mesurer la différence en quantité d’un acide nucléique cible entre les différents échantillons 32.
la méthode comparative de Livak (2-ΔΔCt ou Cp)
R=N’1/N’2= 2-(Ctgène1-Ctref1)-(Ctgène2-Ctref2)
Où N’1 est la quantité normalisée d’ADNc (cible) du gène d’intérêt dans la condition 1 N’2 est la quantité normalisée d’ADNc du gène d’intérêt dans la condition 2
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Ctgène1 est le Ct obtenu lors de l’amplification du gène d’intérêt dans la condition 1 Ctgène2 est le Ct obtenu lors de l’amplification du gène d’intérêt dans la condition 2 Ctréf1 est le Ct obtenu lors de l’amplification du gène de référence dans la condition 1 Ctréf2 est le Ct obtenu lors de l’amplification du gène de référence dans la condition 2 33.