L’analyse quantitative des composés phénoliques non volatils contenus dans les vins a été réalisée par Chromatographie Liquide à Ultra haute Performance, après optimisation d’une méthode de séparation pour les vins blancs et rouges (Figure 20). Les vins étaient préalablement filtrés (filtre à seringue Uptidisc de 0,20 µm). Les standards des composés phénoliques utilisés (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne et Extrasynthèse, Genay, France) ont été passés en UPLC pour établir des courbes de calibration permettant la quantification de ces mêmes composés dans les échantillons de vins. L’identité des pics dans les vins a été validée par comparaison des temps de rétention et des spectres UV ainsi que Fluo dans le cas du resveratrol.
Le système d’acquisition UPLC (Waters, Milford, MA, USA) était équipé d’un détecteur à barrette de Diode (PDA) de modèle 2996, d´une pompe Auto-Blend et d´un
pellicule s
µl d’échantillons étaient injectés avec un débit de 0,25 ml.min-1 sur une colonne BEH C18 (150x2,1 mm, 1,7 µm ; Waters) dont la température était maintenue à 35°C tandis que les échantillons étaient gardés à 8°C. L'élution était réalisée grâce à un gradient de deux solvants (solvant A : eau-méthanol-acide formique 100:5:0,1 (v/v), et solvant B : méthanol). Les composés étaient détectés par une barrette de photodiode entre 250 et 360 nm. Le système optimisé consistait en un gradient pas à pas comme suit : de 3 à 5 %B (0-4 min), 5 à 8 %B (4-10 min), 8 %B (10-12 min), de 8 à 10 %B (12-14 min), de 10 à 15 %B (14-17 min), de 15 à 30.1 %B (17-19 min), de 30.1 à 38 %B (19-21 min), de 38 à 41 %B (21-24 min), de 41 à 50 %B (24-30 min), de 50 à 100 %B (30-31 min), 100 %B (31-31,5 min), de 100 à 3 %B (31,5-32,5 min) et 3 %B (32,5-35 min). Ce programme optimisé a permis l’excellente séparation de 23 composés standards (Figure 20).
Figure 20: Chromatogramme des composés phénoliques standards séparés par UPLC avec détection à 280 nm.
3.3 Métabolomique
Les analyses métabolomiques ont toutes un déroulement similaire et la Figure 21
illustre le cheminement classique d’une étude non ciblée. En outre, une partie des travaux réalisés durant cette thèse porte précisément sur cet aspect de développement méthodologique qui sera présenté en détails dans le chapitre 1 de la partie résultats et discussion. Nous ne détaillerons donc ci-dessous que les caractéristiques spécifiques aux outils employés.
Figure 21: Schéma résumant l'analyse métabolomique pour chaque étude. Après la préparation d’échantillons, les mesures (FTICR-MS et LC-MS) et les processus de calibration commencent. Les spectres sont ensuite alignés et intégrés dans des matrices. La phase de pré-traitement des données est suivie par l’analyse statistique. Une liste de biomarqueurs possible est extraite et représentée graphiquement (van Krevelen). La composition de ces biomarqueurs est exposée par l’interrogation de bases de données et l’analyse des voies métabolomiques. La vérification de l’annotation des biomarqueurs est alors réalisée à l’aide d’une analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS²) permettant l’identification de la structure.
3.3.1 FTICR-MS
Les vins ont étés analysés par un spectromètre de masse SOLARIS (Brucker Daltonics, Brème, Allemagne), équipé d’un aimant supraconducteur de 12 Tesla (Magnex, UK). L’instrument est équipé d’une source d’ionisation par électro spray Apollo II avec la capacité d’ionisation en mode négatif ou positif. Les échantillons peuvent être injectés directement dans une source micro electrospray avec un débit de 120 µL/h. L’injection peut
calibration externe utilisant une solution de cluster d’arginine à 5ppm préparée quotidiennement est réalisée avant chaque début de run, avec une tolérance de 0,2 ppm. Les spectres ont été enregistrés avec 500 accumulations pour un domaine de 4 MW (megawords), en ionisation négative et pour des valeurs comprises entre m/z 100 et 1000. La préparation d’échantillons pour l’analyse en FTICR-MS consistait en une simple dilution du vin (ou des extraits de pellicule et de pulpe) dans du méthanol dans les proportions 1/20 (soit 50 mL dans 1mL).
Les spectres obtenus par analyse FTICR-MS étaient ensuite calibrés en interne à l’aide d’une liste de masse contenant des acides gras et des composés quasi ubiquitaires du vin (Annexe 1), puis filtrés avec un rapport signal sur bruit (S/N) de 4.
La résolution de masse est suffisamment importante, notamment pour les échantillons complexes, pour permettre la différenciation de signaux extrêmement proches les uns des autres (m/z). La résolution d'un instrument est définie par la finesse de ses pics à un pourcentage spécifique de la hauteur des pics, communément 50% en FTICR-MS ou ToF-MS [44]. De plus la résolution est bien plus élevée dans le domaine des petites masses (Figure 22).
R =
m/z (masse observée expérimentalement)
Figure 22: Visualisation de la très haute résolution de la FTICR-MS aux masses 219,05087 et 453,05556 permettant de constater la baisse de résolution avec les hautes masses.
La précision de masse augmente quant à elle de façon synergique avec la résolution et détermine à quel point les masses mesurées expérimentalement reflètent les masses exactes calculées. L’erreur relative est calculée selon le rapport Δm/z (variation de masse entre la masse expérimentale et la masse exacte) sur m/z (masse expérimentale) x 106 :
Erreur relative [ppm] =
3.3.2 UPLC-Q-TOF -MS
Les vins ont ensuite été analysés en utilisant un système de chromatographie liquide à ultra haute performance (Water Acquity UPLC) couplé à un spectromètre de masse UHR-ToF-MS (maXis, Bruker, Allemagne). Deux différents modes de séparation ont été utilisés, la chromatographie en phase inverse (RP) et la chromatographie d'interaction des liquides hydrophiles (HILIC). En mode RP, les métabolites moyennement polaires à apolaires ont été séparés en utilisant une colonne BEH C8 (150 mm x 2,1 mm ID) avec un gradient d’acétonitrile (ACN). Le tampon A consistait en un mélange constitué de 10% ACN dans de l’eau et le tampon B était de l’ACN pur. Les deux tampons ont été additionnés de 0.1% d’acide formique. La séparation des métabolites polaire a été réalisée en utilisant une colonne BEH Amide (150 mm x 2,1 mm ID) avec un gradient passant de 95% d’ACN et 5% d’eau à 50% d’ACN et 50% d’eau, les deux ont été additionnés de 10 mM d’ammonium formiate et
de 0,1% d’acide formique. La préparation d’échantillons pour l’analyse en UPLC-Q-ToF-MS consistait en l’addition de 10 % d’ACN au vin centrifugé.
La détection a été réalisée en mode d’ionisation négative avec les caractéristiques suivantes : pression Nebulizer = 2,0 bar, débit du gaz = 8,0 l/min, température du gaz = 200°C, voltage du capillaire = 3500 V, domaine de masse = 50 à 1000 m/z. La résolution est supérieure à 20000 pour des m/z de 300 et la précision de masse inférieure à 2 ppm dans le cas de l’utilisation d’un instrument UHR-q TOF (Figure 23). Les problèmes majeurs de la chromatographie sont la superposition de pics et les décalages de temps de rétention, ce qui peut être maîtrisé par la déconvolution, l’addition de marqueurs de temps de rétention et l’alignement des données obtenues. Pour ce faire, le logiciel Genedata Expressionist Refiner MS permettant la production de matrices construites à partir des identifiants des échantillons, des caractéristiques chromatographiques et de valeurs comme par exemple l’aire des pics et les intensités maximales a été utilisé (Chapitre 1 de la partie résultats et discussion).
Figure 23: Comparaison de la résolution (R) et de l’erreur de calcul de la masse (error) pour deux pics de masses m/z 227,07136 et 227,12887, permettant de constater la différence de résolution entre RP-UPLC-MS (en bleu) et FTICR-MS (en gris).
3.3.3 La spectroscopie de fluorescence
La fluorescence de vins blancs a été mesurée par spectrométrie de fluorescence en matrice d'excitation et d'émission (EEMF). Cette méthode est efficace pour les solutions transparentes ou diluées, donc tout à fait appropriée pour l'analyse de vins blancs. Les spectres EEMF ont été générés avec un instrument Aqualog Spectrofluoromètre (HORIBA,
Edision, NJ, USA) (Figure 24) équipé d´une source de lumière de xénon de 150W. Le détecteur à angle droit mesurait l’excitation par intervalles de 3 nm entre 225-600 nm et l'émission de 210 à 620 nm. Les vins ont été dilués dans un rapport de 1/40 dans de l’eau ultrapure. La cuve (3mL) possèdait une longueur du trajet optique de 1cm. 320 vins blancs, de cépage chardonnay et provenant de différentes appellations en Bourgogne, ont été analysés permetant la création d´un model pour l´analyse statistique par PARAFAC (Figure 25). Les millésimes analysés couvraient une large période de 1934 à aujourd’hui.
Les signaux EEMF ont été corrigés pour tenir compte de la dispersion de Rayleigh et de Raman avec une dilution dans de l’eau ultra pure, et normalisés quotidiennement avec un “blanc” de sulfate de quinine. Les spectres ont été analysés par le logiciel Origin (OriginLab, Northampton, MA, USA). Les spectres finaux ont été décomposés statistiquement par l'analyse parallèle des facteurs (PARAFAC) pour en retirer des composantes statistiques permettant d’expliquer les variations entre échantillons. La méthode statistique PARAFAC a été utilisée pour modéliser l’ensemble des données obtenues en utilisant un algorithme alternatif aux PLS en trois dimensions. Le modèle a quant à lui été construit à l’aide du logiciel SoloMio (Eigenvector Research Inc., Wenatchee, WA).
Figure 24: Spectromètre de Fluorescence Aqualog et spectre EEMF pour un vin blanc de cépage chardonnay et de millésime 2010.
Ainsi 324 échantillons de vins, provenant d’origines et de millésimes différents et présentant des états d’oxydation variés ont étés analysés par EEMF. Ils ont permis la construction du modèle statistique PARAFAC et l’extraction de quatres composantes
principale significatives (Figure 25), dont les deux premières (C1 et C2) sont majoritaires à plus de 80%.
Figure 25 : Spectre EEMF typique d'un vin blanc de Bourgogne et composantes PARAFAC (C1, C2, C3 et C4) déterminées pour l'ensemble des vins blancs de Bourgogne analysés.