IV. TRAVAUX REALISES
IV.4 Etude de l’amidon du fruit à pain
IV.4.1.5 Analyses de la structure moléculaire
IV.4.1.5.1 Pré - traitement des amidons purs
Cette étape est nécessaire pour une bonne solubilisation de l’amidon dans l’eau avant les
mesures de Chromatographie d'exclusion stérique (HPSEC), ou de dosage de l'amylose par la
CLI (Capacité de Liaison à l’Iode). Ce traitement détruit complètement la structure granulaire de
l’amidon et enlève les lipides présents dans l'amidon.
Mode opératoire : Environ 500 mg d'amidon de fruit à pain ont été solubilisés dans 20 mL de
DMSO (95 %) pendant 5 jours. L'échantillon a été précipité dans 200 mL d'éthanol (95 %), puis
laissé à sédimenter. Il a été centrifugé à 27000 g durant 10 min à 20 °C (KR25i, Jouan,
St-Herblain, France). Le précipité a ensuite été filtré sur un verre fritté de porosité G4 (10 – 16 µm)
par rinçage avec 3 * 3 mL de DMSO puis 3 * 3 mL d'éthanol. Le précipité a été lavé trois fois
avec 60 mL d'éthanol, puis lavé deux fois avec 100 mL d'acétone. Les amidons ainsi traités
sont conservés sous atmosphère sèche en présence de sorbsil®.
IV.4.1.5.2 Teneur en amylose
L'amylose a la capacité dans des conditions bien définies de former des complexes d'inclusion
avec des molécules hydrophobes comme l'iode, les lipides ou les alcools. Il est ainsi possible
de déterminer la quantité d'amylose présente dans l'amidon à partir de l'absorption de l'iode qui
peut être mesurée par ampérométrie ou par sprectophotométrie
a) Capacité de Liaison à l’Iode (CLI)
Cette méthode consiste à déterminer la teneur en amylose d’un amidon par dosage
ampérométrique. Il s'agit de la mesure de la résistivité de la solution correspondant à la
complexation progressive de l'iode par l'amylose.
L’iode est générée in situ par réaction chimique entre l’iodure (I
-) présent en excès dans le
milieu et l’iodate ajouté (Larson et al.,1953) :
L’iode libérée dans le milieu se complexe aux glucanes linéaires présents dans l’amylose.
En parallèle à cette réaction chimique, un courant est généré dans la solution (tension imposée
de 250 mV), de façon à créer une faible différence de potentiel entre deux électrodes de platine.
Le potentiel ampérométrique est constant à l’ajout d’IO
3-, car il y a formation d’iode fixé aux
glucanes. Quand les ions IO
3-ne se fixent plus sur l’amylose, les électrodes se dépolarisent, le
potentiel augmente et est mesuré par un galvanomètre (0,2 µamp.mm
-1).
Figure 58 : Résistivité d’une solution d’amylose pure en fonction de l’ajout d’iodate de potassium
L'évolution de la résistivité mesurée en fonction de la quantité d'iodate de potassium ajoutée en
est tracée (voir l'exemple de la Figure 58). L'extrapolation de la partie linéaire de la courbe à
partir du point d’inflexion sur l'axe des abscisses donne le point d'équivalence correspondant au
volume titrant.
La capacité de liaison à l’iode (CLI) est alors déterminée par la relation suivante :
Avec : CLI, en mg / 100 mg d’échantillon
V, le volume titrant d’IO
3-en mL
PE, la prise d’essai en mL
C, la concentration en α – glucanes de la solution en mg.mL
-1Mode opératoire : 20 mg d'amidon prétraité au DMSO sont dissouts dans 5 mL de KOH 1 N
pour l'amidon, et 5 mg dans 5 mL de KOH 1 N pour l’amylose de référence, à 4 °C pendant 3
jours. La solution d'amidon obtenue a été diluée au 1/100
èmepour avoir une concentration
d'environ 5 mg.mL
-1(KOH 1 N, HCl 0,1 N, eau), et celle du témoin amylose pure au 1/20
èmepour une concentration de 1 mg.mL
-1. Les mesures ont été effectuées sur 1 mL placé dans une
cuve thermostatée. 2 mL d'HCl 1 N, 1 mL de KI 0,4 N et 15 mL d'eau y ont été ajoutés. Le
dosage a été effectué avec du iodate de potassium. La mesure du potentiel ampérométrique a
été faite avec un galvanomètre Mettler Toledo DL53 à 25 °C.
b) Mesure spectrophotométrique du λmax
Il s'agit d'une autre méthode de mesure de la teneur en amylose par la détermination de la
longueur d'onde au maximum d'absorption. L'absorption de l'iode donne une coloration au
complexe amylose / iode. La mesure de la longueur d'onde informe alors sur la longueur des
chaînes. Plus le λ
maxest élevée, plus la longueur des chaînes sera importante.
Mode opératoire : Les solutions préparées pour le dosage par CLI ont été les mêmes que pour
la mesure du λ
max. Le pourcentage d'amylose après filtration (5 µm) a été mesurée avec le
spectrophotomètre JASCO V-530 (Jasco Corporation, Tokyo, Japon) en UV / visible entre 450
et 750 nm.
IV.4.1.5.3 Chromatographie d'exclusion stérique couplée à une détection par
diffusion de la lumière multi-angles (HPSEC – MALLS)
a) Chromatographie d'exclusion stérique
La Chromatographie d'Exclusion Stérique (SEC) est une technique de chromatographie en
veine liquide permettant de fractionner les polymères en fonction de leur taille par élution au
travers d'une colonne remplie d'une phase stationnaire poreuse. Couplée à une détection
réfractométrique (RI) et par diffusion de la lumière (MALLS), cette méthode permet d'accéder
aux distributions en taille et en masses molaires des polymères considérés, et d'approcher leur
structure moléculaire.
b) Détection par diffusion de la lumière
L'analyse de chaque fraction obtenue en sortie de colonne (SEC) au moyen de la diffusion de
lumière multi-angles (MALLS) permet de déterminer en chaque point des distributions, la masse
molaire moyenne en poids Mp et le rayon de giration en z R
Gzen utilisant la relation de la
diffusion de lumière simplifiée du terme de concentration :
Avec :
c, la concentration en polymère
K, la constante optique
λ, la longueur d'onde du faisceau laser
θ, l’angle d'observation
Rθ, le rapport de Rayleigh
Avec R
Gi, le rayon de giration de la fraction i
M
i, la masse molaire de la fraction i
L’extrapolation à angle nul et la pente de la droite d’ajustement de la droite d’équation (Kc/ Rθ)
i= f (sin
2(θ/2)) permettent alors de déterminer respectivement la masse molaire M
iet le rayon de
giration R
Gide la fraction i considérée. A chaque volume correspond alors un rayon de giration
R
Gi, une concentration C
i(déterminée par réfractométrie) et une masse molaire M
i. Il est alors
possible de tracer log (M
i) = f (V
élution). On en déduit pour chaque échantillon la valeur au
sommet du pic Ri (c'est-à-dire la valeur de la masse molaire de la fraction majoritaire), la masse
molaire moyenne en nombre Mn et en poids Mp.
Les masses molaires en nombre Mn, en poids Mp, l'indice de polydispersité Mp / Mn et le
rayon de giration moyen en z, R
Gzsont déterminés en utilisant les moyennes calculées sur
chaque pic :
Pour une distribution donnée, la valeur de Mn sera influencée par les molécules les plus
abondantes alors que la valeur de Mp sera influencée par la présence de molécules de fortes
masses.
c) Traitement des données