Chez les animaux d’une même espèce, il existe de grandes variations interindividuelles, cela est aussi vrai chez les souris utilisées en laboratoire même si elles proviennent de lignées établies depuis longtemps [219]. Il aurait été intéressant d’effectuer l’étude avec un plus grand nombre d’individus. Cela va de soi qu’une plus grande quantité d’individus desquels nous pouvons prélever les tissus aurait permis des analyses plus précises puisqu’en produisant un regroupement (« pool ») des tissus de plusieurs individus, les résultats ne relèvent pas autant de la variation interindividuelle et sont plus représentatifs de la situation chez l’ensemble de ceux-ci. De plus, la grosseur de certains tissus provenant des souris (vésicule biliaire, tissus intestinaux et tissus du système reproducteur, entre autres) a été un élément limitant de cette étude. Nous n’avons pu compléter l’entièreté des expériences avec les mêmes individus puisque chacun ne nous fournissait pas suffisamment de matériel biologique. Le manque de tissu est d’ailleurs la cause de l’absence d’une analyse protéique des Ugt2b dans les tissus conjuguant le BPA. Il sera intéressant d’effectuer ces expériences à l’aide de nouvelles souris dans le futur en raison de l’activité importante de la vésicule biliaire et l’absence d’étude sur l’expression des enzymes UDP-glucuronosyltransférases de ce tissu.
En ce qui concerne la vésicule biliaire, ce tissu s’est révélé avoir une très forte conjugaison pour le BPA. Or, son activité de glucuronidation n’a encore jamais été rapportée et ce tissu est généralement uniquement considéré pour son rôle dans le stockage de la bile, du cholestérol, des phospholipides [220] ainsi que le stockage des dérivés glucuronides avant leur excrétion dans l’intestin. Des analyses supplémentaires sur ce tissu qui s’est révélé être celui avec la plus grande activité enzymatique pour le BPA après le foie auraient été d’un grand intérêt, mais comme il a déjà été mentionné, nous n’avions pas suffisamment de matériel biologique en notre possession pour pousser les analyses plus loin. D’autant plus que nous ne nous doutions pas d’une telle activité a priori. Des études au niveau des cellules du tissu chez la souris et l’homme, comme mentionné précédemment, afin de déterminer l’absorption et le métabolisme du BPA par celles-ci
permettront de mieux comprendre le rôle de ce tissu au niveau de la conjugaison. De même, nous n’avons malheureusement pas pu obtenir ce tissu de l’homme durant la période de l’étude. Dans le futur, il serait indéniablement intéressant d’étudier l’activité de celle-ci, afin de déterminer en quoi son activité pour le BPA est comparable à ce que nous avons observé chez la souris et ainsi effectuer des extrapolations plus juste en ce qui concerne l’homme lors d’études utilisant ce rongeur. Enfin, déterminer si ce tissu possède la capacité de conjuguer d’autres substrats, tels les androgènes, dans le but de mieux comprendre l’importance de cette activité sur le métabolisme des rongeurs serait une piste à suivre pour de prochaines expériences. Il est possible que le rôle de ce tissu se révèle nettement plus important puisqu’il n’a encore jamais été étudié dans un contexte où il est capable d’effectuer la glucuronidation de composés [49, 220].
Il est bien établi au niveau de la littérature que les niveaux d’expression des enzymes UGT varient en fonction de l’âge chez l’humain [221, 222] et les rongeurs [223, 224]. Dans une perspective d’accroître nos connaissances au niveau du métabolisme de conjugaison des différents substrats étudiés au cours de ce projet de maîtrise, il serait pertinent d’évaluer la capacité de conjugaison des tissus d’individus provenant de différent groupe d’âge des souris (fœtus, nouveau-nés, ainsi que femelles en gestation), puisque dans cette étude nous avons seulement utilisé des souris adultes. Étant donné qu’il y a aussi des différences au niveau de l’expression des enzymes du métabolisme lors de la gestation [225], il est aussi nécessaire d’étudier des souris femelles à différents stades de gestation, tout comme des fœtus et des nouveau-nés à différents niveaux de développement, dans le but d’évaluer les différences au niveau du métabolisme des molécules étudiées par les variations d’expression des enzymes. De plus, cela permettrait aussi d’évaluer les moments au cours du développement où la susceptibilité par rapport à l’exposition au BPA est plus importante. Une meilleure compréhension de l’action des enzymes à différents âges permettrait de mieux transposer les résultats à la situation chez l’homme, ce qui est important puisqu’une exposition au BPA en début de vie est un facteur de risque important au niveau du développement de maladie chez l’adulte, tel le développement de lésion au niveau de la prostate [226, 227].
Il a déjà été rapporté lors d’essais cellulaires que le BPA possède la capacité d’affecter l’expression d’une majorité des enzymes du métabolisme [228]. Lors de traitement de cellules HepG2, une diminution
d’expression des ARN messagers des enzymes UGT2B15 et 2B17 a été observée [228-230]. Cet effet peut potentiellement venir de la capacité qu’a le BPA à se lier à plusieurs récepteurs nucléaires, tels les récepteurs aux œstrogènes ! et " (ER! et ER") et le récepteur aux androgènes (AR) [146], et l’influence de ces récepteurs sur l’expression des UGT2B15 et 2B17 (augmentation et diminution, respectivement) [15] chez l’homme. C’est pourquoi, même si nous n’avons pas abordé cet aspect lors de notre étude, le traitement de cellules de source murine constitue une voie d’étude intéressante, afin de déterminer l’effet de la présence du BPA sur l’expression des Ugt2b de souris et donc sur la régulation de son métabolisme.
2. Analyses complémentaires
Nous avons d’abord voulu parfaire nos connaissances des mécanismes de conjugaison des androgènes ainsi que du perturbateur endocrinien, le BPA, par les enzymes Ugt2b murines. Nous voulions savoir si l’absence d’androgène glucuronide en circulation chez la souris était due à une incapacité des enzymes ou si cela provenait plutôt de différences anatomiques par rapport à l’homme [218]. Nous avons en premier lieu procédé à des essais enzymatiques incluant l’ensemble des enzymes Ugt2b de souris, cela a aussi été le cas pour le BPA. Après avoir observé qu’il y avait bel et bien formation d’androgènes glucuronides et identifié les principales enzymes responsables de la conjugaison, nous avons voulu savoir quels étaient les tissus possédant la capacité de prendre en charge ces molécules. Nous avons ensuite procédé à des essais de cinétique sur les enzymes, ainsi que les tissus d’intérêts (foie, vésicule biliaire, tissus intestinaux, gonades). Cela nous a permis d’établir les paramètres des réactions des enzymes et des tissus pour chacun des substrats.
En effectuant des analyses d’ARN messager, nous avons pu établir s’il y avait cohérence avec les résultats d’essais enzymatiques des tissus. De plus, nos résultats étaient sensiblement similaires avec ce qui a été précédemment rapporté par Buckley et Klaassen au niveau de l’expression des ARN messagers des Ugt2b au niveau du foie et du rein [206]. Malheureusement, il a seulement été possible d’effectuer des analyses protéiques par immunobuvardage lors des expériences concernant les tissus conjuguant les
androgènes. À la lumière des résultats obtenus, cette analyse aurait été très intéressante à faire avec la vésicule biliaire qui s’est démarquée par sa forte capacité de conjugaison du BPA, mais pour des raisons expliquées précédemment cela nous a été impossible durant le projet. De plus, l’analyse protéique des Ugt2b n’est pas très précise étant donné qu’il n’existe pas d’anticorps précis pour les enzymes de souris et que nous utilisons un anticorps pour les enzymes UGT2B humaines. Cependant, dans le futur des analyses en protéomique pourront être effectuées, afin d’obtenir des résultats d’une plus grande précision puisque l’anticorps utilisé ici nous permettait uniquement de déterminer s’il y avait présence des Ugt2b sans pour autant avoir la capacité de distinguer individuellement chacune des enzymes UGT murines.
Une expérience qui n’a pas été abordée et qui aurait eu lieu d’être en raison du lien unissant les deux études de ce projet de maîtrise est la compétition entre les substrats androgéniques et le BPA pour les enzymes Ugt2b. Des essais combinant les substrats auraient permis de mieux comprendre les mécanismes de conjugaison qui se déroulent in vivo, lorsqu’il y a présence du perturbateur endocrinien. Cela pourrait mettre en évidence les effets entraînés par ce denier sur le métabolisme normal des androgènes et si celui-ci affecte l’affinité des enzymes pour les androgènes. Il est effectivement possible que par sa présence, le BPA, dans la perspective où il entre en compétition avec les androgènes, entraîne une diminution de la conjugaison des androgènes et donc une augmentation de ces derniers dans la circulation. Dans le cas contraire, la présence des androgènes pourrait avoir un effet sur le métabolisme du BPA et diminuer la conjugaison de celui-ci lorsqu’il y a une forte concentration d’androgène. Une autre possibilité d’interaction entre le BPA et les androgènes pour les enzymes Ugt2b est l’allostérie. Il serait donc intéressant d’évaluer si la liaison des enzymes Ugt2b au BPA ou aux androgènes influence positivement, négativement ou bien n’a pas d’influence lorsqu’il est question de la conjugaison. Dans le cas des molécules étudiées pour ce projet de maîtrise, il est aussi possible que des mécanismes plus complexes, comme l’allostérie, entrent en jeu lors de la conjugaison par les enzymes Ugt2b. L’allostérie peut se définir comme l’influence sur l’affinité et la vitesse de réaction d’une enzyme suite à la liaison d’une molécule pour un autre substrat [231]. Or, malgré que les UGT possèdent un seul site de liaison, il est possible que les enzymes se rattachent les unes aux autres pour former des complexes de deux (dimères) ou quatre enzymes (tétramères). Toutefois, lorsque nous utilisons
des microsomes d’enzymes provenant des HEK293, une seule enzyme y est exprimée et les complexes formés sont donc avec la même enzyme, alors qu’en utilisant les microsomes provenant d’un tissu, tel le foie, les complexes peuvent se former avec différentes enzymes. La compétition des substrats devra donc être évaluée en tenant compte de la formation de ses complexes chez l’homme comme chez la souris [232].
La glucuronidation est la voie majeure pour l’élimination du BPA [192], bien que la molécule est aussi métabolisée chez les rongeurs in vitro en 3-hydroxy-BPA (BPA-catéchol) et en BPA-o-quinone par les cytochtome P450 [233, 234]. Malgré cela, l’absence de conjugaison du BPA dans les tissus en périphérie demeure d’une certaine importance puisque la majorité des tissus des mammifères ont la capacité de déconjuguer les composés glucuronides grâce à l’enzyme β-glucuronosidase [235] et que cela pourrait potentiellement résulter en une exposition plus importante des tissus au BPA chez la souris. On peut ainsi croire que le faible taux de glucuronidation de ces substrats en périphérie du tractus gastro-intestinal est un exemple des différences majeures qui existent au niveau du métabolisme entre l’homme et la souris.
L’étude démontre aussi que la gonadectomie, qui a pour conséquence le retrait de la source endogène des androgènes, entraîne une réduction majeure de l’expression des Ugt2b1 et Ugt2b37 ainsi que de la capacité de glucuronidation du foie et des reins. Puisqu’en fournissant des hormones exogènes, c’est-à- dire la DHT, la capacité de glucuronidation des androgènes a été partiellement rétablie, cela suggère que les androgènes agissent comme des régulateurs positifs de l’expression des Ugt2b1 et Ugt2b37 et sont donc capables de stimuler leur propre glucuronidation. Cela est encore une fois différent de la situation chez l’homme où les androgènes, ainsi que leur récepteur nucléaire, ont été identifiés comme régulateur négatif de l’expression des enzymes conjuguant les androgènes (UGT2B15 et UGT2B17) [16, 126, 127]. Ces observations démontrent donc des différences majeures entre les enzymes effectuant la glucuronidation des androgènes chez l’homme et la souris. De plus, effectuer l’expérience de gonadectomie en parallèle avec la glucuronidation du BPA pourrait être intéressant, puisque l’effet d’un surplus d’androgène a déjà été observé chez le rat [236]. En effet, une diminution de l’expression de l’ARN messager de l’UGT2B1 a été observée en situation hyperandrogénique, ce qui a probablement été la cause de la diminution de la production de BPA-G mesurée [236]. Chez l’homme, le BPA a la capacité d’activer le AR et d’ainsi inhiber l’expression de
l’UGT2B15 ce qui résulte en une diminution de la conjugaison des androgènes et donc une plus forte concentration en circulation. Inversement, lorsqu’il y a une plus forte concentration d’androgène, l’enzyme UGT2B15 est diminuée et entraîne donc une plus faible conjugaison du BPA et une exposition plus importante à ce perturbateur endocrinien. La situation chez la souris doit donc encore être étudiée pour déterminer l’influence d’une variation des androgènes sur l’expression des Ugt2b et sur la conjugaison du BPA. Comme l’influence du AR sur les UGT a déjà été étudiée chez l’homme [15, 16, 126, 127] il serait aussi pertinent d’étudier l’influence qu’a le AR sur les Ugt2b chez la souris.
3. Perspectives et applications pratiques
Les résultats de ce projet et de ceux à venir seront utiles pour une meilleure extrapolation des résultats d’études sur le métabolisme de molécule endo- et exocrines chez l’homme, utilisant la souris comme modèle animal. Bien que les primates non humains seraient des modèles plus représentatifs en ce qui concerne la glucuronidation [196], les souris et les petits rongeurs sont fréquemment utilisés pour des raisons évidentes (faibles coûts d’élevage, croissance et reproduction rapides, etc). Nous réalisons que de plus en plus de composés entrant dans la fabrication d’objets à utilisation courante peuvent avoir certains effets adverses sur l’homme [237], telles les molécules de remplacement du BPA (BPS, BPF, BPAF) qui sont déjà sous haute surveillance [238, 239]. Pouvoir faire la part des choses et déterminer les composés pouvant bel et bien être nocifs peut s’avérer être une tâche ardue. Étant donné l’importance d’établir avec certitude les effets de certains composés et la dose dangereuse de ceux-ci, posséder un modèle animal fidèle chez lequel les résultats peuvent être extrapolés à l’homme est un objectif primordial. La souris étant couramment utilisée comme modèle mammalien, il est parfois facile d’oublier que le rôle d’un modèle animal est de représenter fidèlement l’organisme étudié, dans notre cas l’humain. Nos résultats démontrent qu’il existe encore des voies métaboliques pour lesquelles nous ne connaissons pas les différences entre la souris et l’homme. C’est pourquoi la transposition des résultats à l’humain n’est pas optimale et nécessite des études supplémentaires pour raffiner nos connaissances. Il reste donc important de garder un certain scepticisme face aux
extrapolations de résultats obtenus sur des tissus de rongeurs en ce qui concerne certains processus qui ne sont pas les mêmes entre les deux espèces. L’utilisation de souris transgéniques avec un foie humanisé pourrait donc être une voie intéressante lors d’étude de toxicité de molécules, tel le BPA [240], puisque le foie de ces souris exprime les enzymes que l’on retrouvent chez l’homme et qu’il y a des raisons de croire qu’elles permettent de mieux comprendre le métabolisme et d’ainsi pouvoir transposer les résultats à l’homme.
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