Analyses biochimiques sanguines

Les concentrations circulantes des différents métabolites sanguins ont été déterminées par spectrophotométrie par des kits commerciaux (SPINREACT) Espagne, pour le glucose, le cholestérol, protéines totales. Le dosage des éléments minéraux (calcium), a été fait par les mêmes kits (SPINREACT) Espagne, avec une lecture au spectrophotomètre (MINDRAY BA-88A) Chine. Le dosage biochimique de l’ensemble des constantes biochimiques a été effectué au niveau de laboratoire d’analyses sanguines du service de Biochimie de l’Etablissement Public Hospitalier (EPH) de Sidi Djillali de Sidi-Bel-Abbès (Annexe 12).

Les principes des méthodes analytiques et les références des techniques utilisées sont regroupés dans le Tableau 05.

Paramètres Méthodes d’analyses ^{Références du Kit de}

Diagnostic Paramètres biochimiques

Glucose Trinder. GOD-POD « SPINREACT » Réf : 1001191

Cholestérol ^{CHOD-POD. Enzymatique}

colorimétrique ^{« SPINREACT » Réf : 100192}

Protéines totales Biuret.Colorimétrique « SPINREACT » Réf : 1001291

Calcium Arsénazo III Colorimétrique-cinétique « SPINREACT » Réf : 1001065

Tableau 5: Tableau récapitulatif des différentes techniques d’analyses biologiques utilisées au laboratoire EPH de Sidi-Djillali de Sidi-Bel-Abbès (2015).

2.3.1.1 Dosage de glucose

Déterminé par la méthode colorimétrique enzymatique Trinder GOD-POD selon le principe suivant :

En présence de glucose-oxydase le glucose est oxydé par l’oxygène de l’air en acide gluconique.

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ß-D-Glucose + O2+ H2O GOD Acide Gluconique + H2O

L’eau oxygénée formée réagit, dans une réaction catalysée par la peroxydase, avec le 4Aminophénazone et le phénol ave la formation d’un dérivé coloré rose.

H2O2+ Phénol + 4-Aminophénazone POD Quinone + H2O

La lecture se fait à la spectrophotométrie du produit coloré en rose à 505 nm.

2.3.1.2 Dosage de cholestérol

Il est déterminé par le test colorimétrique enzymatique au cholestérol estérase / peroxydase selon le principe suivant :

Sous l’action de la cholestérol-estérase, les esters du cholestérol sont scindés en cholestérol et acides gras selon la réaction :

Cholestérol ester + H2O Cholestérol Estérase cholestérol + acide gras

Sous l’action de la cholestérol-oxydase, le Cholestérol est transformé en présence de l’oxygène, en 4 – Cholesténone avec formation d’eau oxygénée.

Cholestérol + O2 Cholestérol Oxydase 4- cholesténone + H2O2

En présence de peroxydase, l’eau oxygénée formée réagit avec l’amino 4-phénazone et le phénol avec formation d’un dérivé coloré rose.

2 H2O2 + 4-Aminophénazone + phénol peroxydase Quinonimine + 4 H2O

L’intensité de la coloration développée est proportionnelle à la concentration en cholestérol dans l’échantillon qui est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde 505 nm.

2.3.1.3 Dosage des protéines totales

Elles sont dosées selon méthode du Biuret. En milieu alcalin, les protéines donnent une couleur violette/bleue en présence de sels de cuivre; ces sels contiennent du iodure qui agit comme un antioxydant.

Protéines + Cu++ milieu alcalin complexe Cu-protéines

L’intensité de la couleur formée est proportionnelle à la concentration de protéines totales dans l’échantillon.

90 La lecture se fait à une longueur d’onde de 540 nm.

2.3.1.4 Dosage de calcium

Dosé par technique colorimétrique à Arsénazo III. Le calcium, en milieu neutre, forme un complexe de couleur bleu avec l’arsénazo III (acide 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-naftalenen-bis (azo)- dibenzenarsonique).

Calcium + 2 Arsenazo III Complexe Ca-Arsenazo (couleur bleue).

L’intensité de couleur est directement proportionnelle à la quantité de calcium présent dans l’échantillon qui est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde 650 nm.

2.3.2 Analyses hormonales

Le dosage hormonal des échantillons sériques a été réalisé au niveau du laboratoire d’analyses sanguines privé à Ain Témouchent.

2.3.2.1 Dosage de testostérone

ARCHITECT 2nd Generation Testosterone est un dosage immunologique en une étape retardée pour la détermination quantitative de la testostérone dans le sérum et le plasma humains à l’aide de la technologie CMIA avec des protocoles de dosage flexibles, appelée Chemiflex. Dans un premier temps, l’échantillon, le diluant spécifique du dosage et les microparticules paramagnétiques recouvertes d’anticorps anti-testostérone (monoclonaux d’origine ovine) sont mis en présence. La testostérone présente dans l’échantillon se lie aux microparticules recouvertes d’anticorps anti-testostérone. Après incubation, le conjugué de testostérone marqué à l’accridinium est ajouté au mélange réactionnel. Après une autre incubation et lavage, les solutions de préactivation et d’activation sont ajoutées au mélange réactionnel. La réaction chimiluminescente qui en résulte est mesurée en unités relatives de lumière (URL). Il existe une relation inverse entre la quantité de testostérone présente dans l’échantillon et les URL détectées par le système optique ARCHITECTi Systems. La concentration de testostérone est obtenue à partir d’une courbe de calibration établie avec les calibrateurs de concentrations de testostérone connues.

2.3.2.2 Réactifs (ARCHITECT 2nd Generation Testosterone Reagent Kit) Appareillage : ARCHITECT i 4000 produit par ABBOTT (Etas-unis) (Annexe 13).

91 2.3.2.3 Domaine d’application

2.3.2.4 Résumé et explication du test

La concentration de testostérone chez un individu varie pendant 24 heures. La libération pulsatile de LH durant la nuit entraîne habituellement un pic de concentration de testostérone le matin. Les heures de la journée, l’âge, le sexe, la puberté, la pré ménopause, la post-ménopause et les maladies ont tous une influence sur la concentration de testostérone et doivent être pris en considération lors de l’interprétation des résultats individuels.

2.3.2.5 Procédure du dosage 2.3.2.6 Reproductibilité

Le dosage ARCHITECT 2^nd Generation Testosterone est conçu de manière à obtenir un coefficient de variation (CV) total d’imprécision intra-labaoratoire ≤ 10 % pour les échantillons présentant des concentrations de testostérone allant de 0.5 nmol/l à 35 nmol/l.

2.3.2.7 Sensibilité

Le dosage ARCHITECT 2^nd Generation Testosterone est conçu de manière à présenter une limite de quantification (LQ) ≤ 0.15 nmol/l, où la LQ est définie comme étant la plus petite qunatité d’analyte présentant un porcentage d’erreur total estimé inférieur au pourcentage d’erreur total (TEa : Total allowable Error) dont les valeurs sont :

TEa = 0.125 nmol/l pour les échantillons dont les concentrations sont ≤ 0.5 nmol/l

TEa = 25 % pour les échantillons dont les concentrations sont > 0.5 nmol/l

La LQ a été déterminée sur la base du document EP17-A du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). La LQ observée pour le dosage ARCHITECT 2nd

Generation Testosterone était de 0.08 nmol/l (2.30 ng/dl).

2.4 Analyse des aliments