Analyses bio-informatiques des nouvelles cibles potentielles

shTAR montrent que le niveau d’expression de plusieurs protéines cellulaires est altéré par l’expression des miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1. L’analyse bio-informatique des ARNm codant pour les protéines qui sont régulées à la baisse chez le clone 3 et qui

Figure 17. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.3.

Les cellules Jurkat ont été mises en culture dans un milieu DMEM supplémenté de G418 (400µg/ml) pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellules ont été mis en culture : 3 clones exprimant l’ARN en tige-boucle de TAR (shTAR) à divers niveaux (Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 : ++, Jurkat-shTAR cl.4 : - ) et un shNEG exprimant une séquence sans aucune similitude avec le shTAR. Les cellules ont été récoltées et lysées selon le protocole décrit à la section 2.1.6. Cinquante (50) µg de chaque échantillon a été analysé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de Québec. Les résultats présentent les rapports d’expression entre les cellules exprimant le Jurkat-shTAR cl.3 (sample 3) et les cellules exprimant le shNEG (sample N). valeurs en vert : sous-exprimées; valeurs en rouge : surexprimées. Seules les protéines montrant une différence d’expression statistiquement significative (p<0,05) ont été incluses dans le tableau. Elles ont été placées en ordre décroissant d’expression en présence de l’ARN TAR. « p value » (pVal)

Figure 18. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.4.

Les cellules Jurkat ont été mises en culture dans un milieu DMEM supplémenté de G418 (400µg/ml) pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellules ont été mis en culture : 3 clones exprimant l’ARN en tige boucle de TAR (shTAR) à divers niveaux (Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 : ++, Jurkat-shTAR cl.4 : - et un shNEG exprimant une séquence sans aucune similitude avec le shTAR. Les cellules ont été récoltées et lysées selon le protocole décrit à la section 2.1.6. Cinquante (50) µg de chaque échantillon a été analysé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de Québec. Les résultats présentent les rapports d’expression des peptides analysés entre les cellules exprimant les Jurkat-shTAR cl.4 (sample 4) et les cellules exprimant le Jurkat- shNeg (sample N). valeurs en vert : sous-exprimées; valeurs en rouge : surexprimées. Seules les protéines montrant une différence d’expression statistiquement significative (p<0,05) ont été incluses dans le tableau. Elles ont été placées en ordre décroissant d’expression en présence de l’ARN TAR. « p value » (pVal)

expriment fortement le shTAR, a de plus permis d’identifier, au sein de certains ARNm, des sites de liaison potentiellement régulés par les miARN dérivés de TAR. Cinq de ces protéines se sont démarquées par le niveau d’appariement élevé entre leur ARNm et la région « seed » des microARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p, soit Exportin-5, SAP-18, eIF4B, RAD23B et Nucleolin (Figure 19).

Figure 19. Sites de liaison des miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p dans les ARNm étant potentiellement régulés, en relation à l’analyse protéomique iTRAQ. Des sites de

liaisons potentiels (BS) pour les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1, i.e. miR- TAR-5p/3p, ont été déterminés par analyses bio-informatiques pour les ARNm codant Exportin-5 (A), SAP18 (B), « UV excision repair protein RAD23 homolog B » (RAD23B) (C), « Eukaryotic translation initiation factor 4B » (eIF4B) (D) et Nucleolin (E). Les flèches sur l’ARNm désignent les sites de liaison potentiels (BS) pour miR-TAR-5p (en vert) et miR-TAR-3p (en bleu). Les barres présentes sur le duplex miARN:ARNm représentent la région seed du miARN. L’appariement miARN: Site de liaison et le « Minimal free energy » (MFE) ont été déterminés avec l’algorithme « RNA Hybrid » (http://bibliserv.techfak .unibielefeld.de/rnahybrid/).« Binding Site », BS; « Minimal Free Energy », « kilocalorie per mole » (kcal/mol); MFE; « Messenger RNA », mRNA; « Nucleotide », nt; « Open reading frame », ORF; « Untranslated Region », UTR

Ces analyses bio-informatiques sont prometteuses, car elles ont montré que ces protéines possèdent de fortes énergies d’appariement (MFE) avec les miARN dérivés de l’élément TAR. De futures analyses avec elles seront nécessaires afin de confirmer leur rôle dans la pathogénicité du VIH-1.

Chapitre 3.

Discussion générale

L’objectif de recherche, au cours de cette maîtrise, était de caractériser les ARNm de l’hôte pouvant être ciblés par les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1. Il a déjà été rapporté que plusieurs virus sont aptes à produire des miARN capables de cibler le génome de la cellule hôte ainsi que leur propre génome (voir section 1.2.1.1). Cette maîtrise venait appuyer l’ajout du VIH-1 à ce répertoire, car en plus de ceux présentés à la section 1.2.3.4, il existe probablement d’autres miARN jouant un rôle dans la pathogénicité du VIH-1. L’équipe de Klase et al. [130] avaient répertorié deux miARN, provenant aussi de la région TAR du VIH-1, différant à quelques nucléotides près de séquences identifiées par notre laboratoire [128]. Ces différences pouvaient provenir de la souche de virus utilisée, du modèle cellulaire ou même des méthodes de séquençage utilisées. Aussi minimes soient-elles, des différences dans la séquence qui compose la région seed des miARN viraux peuvent en effet avoir des conséquences importantes sur le répertoire des ARNm cellulaires pouvant être régulés, entraînant par là des phénotypes totalement différents pour chaque séquence. Il était donc de mise, pour améliorer la compréhension de la pathogénèse du VIH-1, (i) d’initier l’étude du rôle des miARN de TAR à l’aide des séquences qui avaient été élucidées par notre laboratoire, (ii) en plus d’identifier et caractériser des ARNm-cibles potentiels.

Il était intéressant de constater que dans la phase asymptomatique de l’infection du VIH-1, seul un court transcrit d’ARN viral, qui provient de la région TAR du VIH-1, est produit dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Cela menait à penser qu’en phase de

latence, le virus produirait un court transcrit d’ARN de TAR qui serait ensuite clivé par Dicer, en des miARN aptes à réguler plusieurs ARNm de la cellule hôte, établissant ainsi un contexte favorable à la réplication du VIH-1. Comme il avait été démontré par notre laboratoire, le court transcrit de TAR, en phase latente du virus, est plus favorable au clivage de la ribonucléase Dicer qu’une version possédant 10 nt protubérants en 3’ [128], ce qui suggère qu’en cette phase, une production de miARN dérivés des TAR aurait lieu, alors qu’une fois engendré le processus d’élongation du 5’LTR du VIH-1, il y aurait une diminution des miARN produits par Dicer dans les cellules en réplication.

De plus, il avait été montré que le VIH-1 infecte les monocytes, mais n’y entre jamais en processus de réplication. La très faible expression, voire l’absence de la ribonucléase Dicer dans ceux-ci les rendrait-elle inaptes à supporter la réplication virale [119, 137]? Une meilleure compréhension des mécanismes de production des miARN viraux et de la régulation génique devait permettre de mieux apprécier le rôle et l’importance des miARN dans la pathogénèse virale.

Des résultats obtenus antérieurement au laboratoire avaient permis de constater, au sein de cellules infectées par « RNase protection assay » (RPA), la présence de miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1, miR-TAR-5p et miR-TAR-3p, et de valider leur fonctionnement dans la voie des miARN, ce qui avait été fait par des analyses de gène rapporteur [128]. La suite logique du projet consistait donc à découvrir les ARNm pouvant être ciblés par les miARN dérivés du VIH-1, question de confirmer leur rôle.

L’une des stratégies utilisées, afin de déterminer la régulation potentielle d’un site de liaison par un miARN, était d’à la fois effectuer, dans un vecteur d’expression psiCHECK et en aval du gène rapporteur de Renilla luciferase, des essais luciférase avec

des constructions contenant 3 fois les sites de liaison au miARN (3XBS), et co-exprimer un vecteur psiSTRIKE pouvant produire des miARN en grande quantité. Les constructions contenant trois fois les sites de liaison en répétition ont été utilisées au préjudice de constructions contenant une seule fois les sites de liaison (telles celles normalement vues in vivo, par exemple), car cette stratégie, utilisée à des fins qualitatives, permettait une amplification du signal de répression de la traduction du gène Rluc par les miARN produits.

Des résultats préliminaires avaient montré que la Procaspase-8, l’une des protéines initiatrices de la mort cellulaire programmée, pouvait être ciblée par les miARN dérivés de l’élément TAR (résultats non-publiés). L’équipe de Klase et al. ayant montré que certains miARN dérivés de TAR protègent les cellules infectées de l’apoptose en altérant l’expression de certains gènes cellulaires [130], il devenait pertinent de vérifier si les miARN miR-TAR-5p et 3p, découverts dans notre laboratoire, pouvaient eux-aussi protéger les cellules infectées de la mort cellulaire en diminuant l’expression de protéines pro-apoptotiques. En utilisant l’algorithme « RNA Hybrid » (http://bibliserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/), un criblage de ces protéines a donc été effectué afin de déterminer leurs sites de liaison potentiels. De ces analyses, trois protéines se sont démarquées par leur énergie d’appariement minimale (« Minimal Free Energy »; MFE) avec miR-TAR-5p et 3p : APAF-1, DIABLO et Procaspase-10 (Figure 8 : (B), (C) et (D)). Les analyses luciférases subséquentes avec elles n’ont cependant pas donné l’effet escompté (Figure 9). La régulation maximale de la Rluc ne dépassant pas 20 %, ces protéines ont été abandonnées du projet. La régulation de 20 % d’une protéine pourrait avoir un effet considérable au sein des cellules, mais les effets de régulation sur les constructions contenant les 3XBS, comparativement aux sites de liaison endogènes de

l’ARNm, devraient être amplifiés. Pourquoi cette différence ? Les constructions 3XBS sont faites pour répondre aux caractéristiques d’un site de liaison ayant le meilleur pouvoir de régulation, c’est-à-dire d’un site de liaison : i) situé dans le 3’UTR au moins à 15 nt du codon stop; ii) situé loin du centre de longs 3’UTR; et iii) situé proche d’un ou plusieurs autres sites de liaison aux miARN, de façon à avoir un effet de coopération à la régulation du gène (voir P.Bartel pour une revue complète [73]).

Pour la suite du projet, étant donné que parallèlement aux 3XBS, un clonage des 3’UTR des ARNm des protéines d’intérêt (BBC3/Puma et Procaspase-8) avait été effectué, ceux-ci ont donc été utilisés directement plutôt que par l’intermédiaire des sites de liaison 3XBS.

Pour BBC3/Puma, une baisse encore une fois de 20 % de l’expression de la luciférase avait été observée, et ce, à la plus forte dose de transfection du psiSTRIKE TAR (250 ng) (Figure 10). Une baisse d’expression de 20% de la luciférase avec une construction 3’UTR est non négligeable, car si de manière endogène un miARN est apte à réduire l’expression d’un messager de 20% via son 3’UTR, des variations, aussi infimes soient-elles, peuvent avoir de grands effets.

BBC3/Puma est une protéine pro-apoptotique membre de la famille Bcl-2, dans la sous-famille des « BH3-only ». Elle est activée par le gène suppresseur de tumeur p53 et engendre la mort cellulaire programmée via la dépolarisation mitochondriale et le relâchement du cytochrome c au cytosol [138, 139]. Une diminution de BBC3 par les miARN dérivés du VIH-1 devrait donc avoir pour conséquence de protéger les cellules infectées de la mort cellulaire, liée aux dommages à l’ADN par l’expression de p53, et ainsi de permettre à l’infection du VIH-1 de se propager dans l’organisme. Cependant, la suite du

projet avec BBC3 n’a pas eu lieu, pour cause de limitation dans la possession de l’anticorps.

Pour ce qui est de Procaspase-8, des constructions avaient été effectuées afin de montrer ses différentes régions pouvant être régulées par le psiSTRIKE-TAR. Il avait été observé que les miARN de TAR exercent principalement leur régulation via la région 3’UTR, par une diminution de 40% de l’expression de Rluc (Figure 11). Les miARN peuvent aussi exercer des effets régulateurs sur la région « Open Reading Frame » (ORF), malgré l’absence de sites de liaison potentiels pour miR-TAR-5p/3p (Figure 12). Des expériences supplémentaires seront nécessaires afin de dénombrer le ou les élément(s) de régulation présent(s) dans cette région.

La Procaspase-8 est l’une des protéines initiatrices de la voie extrinsèque de l’apoptose classique. Elle agit via des récepteurs de mort cellulaire et le « death-inducing signaling complex » (DISC) [140]. Il a été rapporté que la mort cellulaire des cellules infectées par le VIH-1 s’effectue principalement par l’activation de la voie extrinsèque de l’apoptose, via le clivage protéolytique de la Procaspase-8 [141, 142]. Il appert donc qu’une diminution de l’expression de la Procaspase-8 pourrait améliorer la survie des cellules infectées par le VIH-1.

Il est important de considérer qu’un résultat négatif dans les essais de gènes rapporteurs ne veut pas nécessairement dire que, in vivo, un ARNm ne sera pas régulé par ces miARN. À l’inverse, un résultat positif demanderait à être confirmé in vivo. Ceci est dû au fait que les essais sont basés sur l’utilisation de vecteurs d’expression qui diffèrent de l’expression endogène : les gènes sont exprimés via un promoteur T7, de sorte qu’ils sont transcrits en très grande quantité, ce qui peut exagérer des réponses ou effets potentiels.

C’est pourquoi les résultats provenant de ces essais doivent absolument être confirmés au niveau des protéines endogènes, afin d’évaluer s’il y a régulation ou non de l’ARNm par les miARN. Ces essais de gènes rapporteurs ont cependant l’avantage de valider les interactions ARNm:miARN et la fonctionnalité des sites de liaison présumés des miARN au sein des ARNm-cibles d’intérêt.

Afin de voir s’il y a une régulation des protéines d’intérêt dans un modèle de cellules infectées in vivo, une collaboration avec le Dr. Michel Tremblay, de l’axe d’infectiologie, avait été faite. Celui-ci nous avait généreusement donné des extraits protéiques de cellules J-lat de la souche 6.3, induites ou non à la Prostratine (10 µM) durant 6 h ou 24 h. Les J-lat sont des cellules de la lignée Jurkat qui ont intégré l’ADN du VIH-1 dans leur génome, mais dont le provirus demeure sous forme latente. L’induction à la Prostratine induit la réplication virale de 30 à 75 % des cellules via l’activation de la voie NF-κB [134, 135]. Tel que vu précédemment dans ce mémoire, en réplication virale, il y a une élongation complète du 5’LTR du VIH-1 et ainsi une possible diminution de la production des miARN dérivés de TAR, ce qui est dû à la formation de longs transcrits qui sont moins clivés par Dicer. Avec une forte réplication virale, donc, devrait s’engendrer une perte de régulation par les miARN dérivés de TAR; une augmentation du niveau d’expression des protéines potentiellement régulées par la forme latente des J-lat devrait par conséquent avoir lieu.

Or les résultats obtenus ne concordent pas avec cette hypothèse (Figure 13). Pour Aiolos et Procaspase-8, après 24h d’induction, il y a une diminution de leur expression, et pour Aiolos, l’apparition d’une bande plus haute (~62 kDa). Pour Ikaros et Nucléophosmine/B23, il y a une légère augmentation du niveau de protéines après 6h

d’induction, qui redescend un peu après 24h. Deux questions ressortent de cela : pourquoi y a-t-il une diminution du niveau protéique d’Aiolos et Procaspase-8 ? Et pourquoi une nouvelle bande apparaît-elle au-dessus d’Aiolos ? Sachant que la Prostratine induit l’expression de NF-κB via la dégradation d’un de ses inhibiteurs [134], il serait possible que NF-κB, en plus de se lier aux promoteurs du VIH-1, lie d’autres promoteurs de gènes, tels des gènes de miARN. Donc, de nouveaux miARN présents au sein des cellules en réplication lieraient des ARNm, tels Aiolos et de Procaspase-8. Cette liaison pourrait même masquer un possible effet des miARN dérivés de TAR et ainsi avoir biaisé l’interprétation de nos résultats.

Cette hypothèse pourrait aussi expliquer les résultats concernant l’apparition d’une nouvelle bande d’Aiolos, supérieure à celle présente sans induction. Sont connues, présentement, six isoformes différents pour Aiolos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Il est donc possible que le facteur nucléaire NF-κB induise l’expression d’une autre isoforme normalement absente de cette cellule. Il est pourtant étonnant de constater que l’expression protéique d’Ikaros et NPM/B23 montre un pic d’expression après 6 h d’induction, car seulement 35% des cellules, après ce temps, sont en réplication [134, 135]. Serait-ce possible que ces changements soient de faux positifs? Des études plus poussées avec ces cellules devraient être envisagées afin de mieux comprendre ces phénomènes et de déterminer si la Prostratine et NF-κB induisent l’expression de gènes autres que ceux du VIH-1, car cela pourrait brouiller les pistes de futures expériences avec elles.

Aiolos et Ikaros sont des facteurs de transcription qui peuvent se dimériser et qui ont été montrés comme régulateurs dans le développement et l’homéostasie des lymphocytes. Ces protéines possèdent six structures « Zing finger » leur conférant la

capacité de lier l’ADN ainsi que des domaines de dimérisation [143-145]. Vu leur importance dans les lymphocytes, une diminution de l’expression de ces facteurs, ou encore la présence d’un nouvel isoforme au sein des cellules, pourraient expliquer les changements des patrons d’expression protéique dans les cellules J-lat.

Ayant obtenus des résultats préliminaires peu concluants avec les cellules J-lat, il avait été décidé de se concentrer sur une analyse complète d’un protéome pouvant potentiellement être régulé par les miARN dérivés de TAR. Dominique L. Ouellet avait produit, au cours de son doctorat, diverses lignées cellulaires Jurkat, exprimant à différents niveaux le shTAR (Figure 14), ainsi qu’un shNEG ciblant une région délétée du gène Rluc. Ce qui était particulièrement intéressant, au sujet de ces lignées, était leur niveau d’expression du shTAR, qui différait d’un clone à l’autre. En mettant en culture ces diverses lignées et en comparant le profil protéique des unes avec les autres, il devait donc être possible d’observer un phénomène dose-dépendance.

Il suffisait, afin de déterminer à large spectre les protéines pouvant être régulées par les miARN, de mettre les cellules en culture, de les laisser croître et de récolter les protéines. Une partie des protéines a donc été analysée par immunobuvardage de type western, tandis qu’une autre a été envoyée à la plate-forme protéomique du Centre de génomique de Québec pour des analyses par spectrométrie de masse.

Concernant les immunobuvardages faits sur les échantillons, seule la protéine Procaspase-8 a montré une diminution d’expression pour les lignées Jurkat-shTAR cl.1 et cl.3, alors que les autres protéines d’intérêt n’ont pas montré de différence d’expression notable (Figure 15).

Pourquoi les résultats des expériences J-lat et des cellules Jurkats exprimant de manière stable le shTAR ne concordent pas ? L’avantage à utiliser des Jurkats stables au lieu de cellules J-lat est qu’il y a moins de chance, ainsi, d’obtenir de faux-positifs/négatifs, leur système de production de miARN étant beaucoup plus simple. Cependant, les cellules J-lat offrent quant à elles un système qui se rapproche de ce que l’on pourrait apercevoir in vivo.

L’utilisation d’un simple vecteur d’expression psiSTRIKE, exprimant la tige-boucle TAR sous pression sélective avec le G418 (400 µg/ml), engendre moins de répercussions au sein de la cellule que des cellules infectées latentes, car celles-ci, lors de l’induction à la Prostratine, engendrent une réplication active du virus ainsi qu’une expression de protéines virales. Ces protéines ont déjà été montrées comme pouvant altérer diverses cascades signalétiques, ce qui peut mener à diverses maladies. Par exemple, par l’effet « bystander », Tat enclenche à elle seule, entre autres, la perméabilisation mitochondriale, le relâchement du cytochrome c, l’inactivation du cytochrome c oxydase (COX), en plus de contribuer au sarcome de Kaposi et à la démence associée au VIH [146-148]. Pour cette raison, les cellules Jurkats stables, qui ont un système plus rudimentaire, ont été utilisées, de façon à démontrer directement, de cause à effet, le rôle des miARN dans la différence d’expression du protéome.

Il est intéressant de constater, comparativement au shNEG, que seulement une douzaine de protéines ont été statistiquement exprimées de manière différentielle dans la lignée Jurkat-shTAR cl.1 (qui exprime peu le shTAR). Ceci supporte l’idée que, le clone 1