Analyse par SDHF de l’effet de la bléomycine couplée à l’électroporation 152

L’étude de ce paragraphe a pour but d’évaluer d’une part, la potentialisation de la

bléomycine avec l’EP sur les cellules THP1, et d’autre part, la capacité de notre bio-capteur à

détecter la perte de viabilité cellulaire induite par la rentrée des molécules de bléomycine grâce

à l’EP. Dans ce but, 5 différents groupes cellulaires ont été étudiés :

 Groupe 1 : Cellules sans traitement, contrôle négatif

 Groupe 2 : Cellules traitées avec 0.02% de saponine, contrôle positif

 Groupe 3 : Cellules traitées avec la bléomycine seule (à 250 nM/L)

 Groupe 4 : Cellules traitées avec le champ électrique seul (à 1 kV/cm)

 Groupe 5 : Cellules traitées avec ECT (250 nM de bléomycine + 1 kV/cm).

Après le traitement, les cellules sont remises en culture pendant 24 heures, avant de procéder

aux mesures hyperfréquences.

Vu le grand nombre de spectres obtenus à l’issue de cette étude, nous présenterons seulement

les résultats des contrastes capacitifs et conductifs, à 5 GHz et à 30 GHz respectivement, comme

le montre la Figure 104. De la même manière que précédemment expliquée, nous procédons à

un tri cellulaire en nous basant sur les valeurs seuils déterminées pour chacun des paramètres

HF.

Par comparaison aux cellules non traitées (mortalité basale à 20%), nous pouvons clairement

établir que lorsque les cellules ne sont traitées qu’avec la bléomycine seule ou ne sont soumises

qu’au champ électrique seul, la mortalité résultante n’est pas sensiblement affectée. Par contre,

le traitement par la bléomycine couplée au champ électrique engendre une augmentation du

nombre de cellules dépassant le seuil et présentant des signatures électriques caractéristiques

de cellules mortes.

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(a)

(b)

Figure 104 : Contrastes (a) capacitif ∆C 5GHz et (b) conductif ∆G 30 GHz des cellules avec différents conditions de traitement.

Une quantification du pourcentage de cellules viables (Figure 105) après le traitement démontre

l’effet potentialisant de l’effet combinée de la bléomycine et de l’EP (= ECT). Les cellules de

contrôle négatif présentent un taux de viabilité aux alentours de 80%. L’EP seule n’a aucun

impact sur la viabilité cellulaire et l’effet de la bléomycine n’est que mineur car la diminution

de la viabilité n’est que de 10%. L’ECT, quant à elle, induit une nette diminution de la viabilité

jusqu’à 50% révélée par ∆C et jusqu’à 35% révélée par ∆G.

Une comparaison statistique entre les résultats obtenus par spectroscopie diélectrique

hyperfréquence et ceux obtenus à l’aide du test d’exclusion par le trypan bleu, montre une très

bonne corrélation (R

>0.97) entre les deux techniques, validant une fois de plus la précision de

notre technique pour révéler les effets de l’ECT sur les cellules.

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Figure 105 : Comparaison de l’évolution des paramètres ∆C et ∆G extrait de l’analyse diélectrique hyperfréquence et des résultats obtenus avec le test d’exclusion au bleu de trypan.

IV.5Conslusion

Ce paragraphe IV vous a présenté les résultats expérimentaux d’analyse par

spectroscopie HF de cellules individuelles ayant subi différents traitements : chimiques,

d’électroporation et enfin d’électrochimiothérapie.

Chaque expérience a été conduite avec un protocole biologique et de mise en œuvre de la

spectroscopie HF strict et compatible avec les 2 domaines en synergie (biologie et électronique

HF). Pour chaque test, une dizaine de cellules a été mesurée successivement (voir Figures 37,

40 et 45) et les données présentées aux figures 38 ,41 et 46 résultent d’expériences tripliquées

(n=3) amenant à des conclusions « statistiquement acceptables » pour les biologistes.

Sur les 9 situations biologiques investiguées, la classification des niveaux des indicateurs de

spectroscopie que sont les contrastes capacitif (∆C) à 5 GHz et conductif (∆G) à 30 GHz se

révèle être en forte corrélation avec la viabilité cellulaire (R

>0.94).

A notre connaissance, c’est la première fois que la spectroscopie HF (dans le domaine du GHz)

de cellule unique révèle des résultats en très forte pertinence (corrélation très forte) avec des

analyses croisées biologiques.

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V. Conclusion

Ainsi, au cours de ce dernier chapitre, nous avons démontré que la spectroscopie HF est

capable de produire des données expérimentales de qualité reflétant les propriétés diélectriques

de cellules individualisées. La capacité de notre biocapteur à discriminer l’état de viabilité

cellulaire a été établi sur une dizaine d’expériences différentes classiquement faites en EP,

chacune étant tripliquée et impliquant une dizaine de cellules analysées.

La classification de viabilité effectuée par spectroscopie a tout d’abord été calibrée en

appliquant un traitement létal aux cellules avec une molécule chimique : la saponine. A l’issue

de cette étude, nous avons défini une valeur seuil sur les deux paramètres diélectrique (∆C à 5

GHz et ∆G à 30 GHz) nous permettant d’établir la classification viable/non-viable. La

classification qui s’en est suivie a été confirmée (corrélée) par des analyses biologiques.

Fort de cette aptitude à la détermination par spectroscopie HF de la viabilité cellulaire, nous

avons appliqué cette technique, avec toujours une dizaine de cellules testées et des expériences

répliquées 3 fois, pour des traitements classiquement employés par les biologistes investiguant

l’EP :

1. EP seule à 1 kV/cm et analyse après 24h,

2. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 24h,

3. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 3h,

4. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 5h,

5. EP seule à 1.5 kV/cm et analyse après 7h,

6. Bléomycine seule à 250 nM et analyse après 24h,

7. Bléomycine à 250 nM et EP à 1 kV/cm (ECT) et analyse après 24h.

L’EP correspond à l’application de 8 impulsions électriques de durée 100 µs et de fréquence 1

Hz. Ces 7 tests, auxquels se rajoutent les contrôles positifs (cellules sans traitement) et négatifs

(cellules traitées avec 0.02% de saponine), sont la résultante de 3 plans d’expérience :

 Analyse par spectroscopie HF de l’effet de l’intensité de champs d’EP  tests 1 et

2 pour des champs de 1 kV/cm puis 1.5 kV/cm

 Suivi post EP par spectroscopie HF  tests 3, 4, 5 et 2 pour un suivi post EP de 3,

5, 7 et 24h

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 Analyse par spectroscopie HF de la synergie EP + Bléomycine  tests 1, 6 et 7 pour

l’EP seule, la Bléomycine seule et la combinaison des deux (=ECT).

L’ensemble des résultats expérimentaux montrent une excellente corrélation (R

>0.94) entre la

spectroscopie diélectrique hyperfréquence et les méthodes d’analyse biologique ce qui révèle

que la technique HF identifie, avec un degré de fiabilité identique à celui des « gold » standards

de la biologie, la viabilité cellulaire.

En conclusion, dans ce chapitre de thèse, nous avons démontré que l’approche par spectroscopie

diélectrique hyperfréquence associée aux microtechnologies permettant une analyse de cellules

individualisées, est une technique fiable et performante pouvant analyser des cellules sous

traitements chimiques et/ou électriques et permettant ainsi d’enrichir la vision que les

biologistes peuvent avoir des cellules.

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