Analyse quantitative des images

Pendant une expérience, on applique, comme on l’a vu au chapitre 3, une série de paliers de forces, chaque palier n étant suivi d’une relaxation de durée à peu près égale. Pendant cette durée, on prend des images en épifluorescence dans plusieurs plans en Z, distants d’un µm environ (cf. 2.4.2). On utilise ensuite un plug-in sous Image J pour analyser ces images.

Des 4 plans situés autour du centre de la bille (et couvrant une hauteur de 3 µm environ, soit l’équivalent de la taille de la bille), on tire une image moyenne, à laquelle on applique un premier filtre lissant ("Smooth"). La figure 4.1 montre un exemple d’images ainsi obtenues (on n’a fait figurer qu’une image sur deux, si bien que l’intervalle entre deux clichés est de 600 s environ, soit deux paliers de force suivis de leur temps de relaxation). On voit très nettement que la quantité d’actine autour de la bille croît au cours du temps, et qu’apparaissent au contact-bille cellule des patches d’actine (points brillants sur les images D et E).

On n’a pas caractérisé la composition moléculaire de ces patches, mais étant donné les nom- breuses études ayant montré la présence d’actine dans les adhésions focales, ainsi que l’apparition de ces adhésions sous force (voir 1.2.4), on utilisera par la suite ce terme d’adhésions focales (FA) pour les désigner.

Fig. 4.1 – Images d’une cellule C2C12 pendant une expérience : (A) en transmission, où l’on voit la bille via laquelle on applique la force (barre : 5 µm) ; (B à G) en épifluorescence, où l’on détecte l’actine-GFP(intervalle entre deux images : 600 s environ, soit l’application de 2 paliers de force ; l’échelle des niveaux de gris n’est pas la même sur les 6 images). Les flèches sur les images D et E pointent vers des patches d’actine apparaissant au contact bille-cellule.

De plus, la quantité d’actine n’augmente pas seulement au niveau de ces patches : on peut constater une augmentation de l’intensité de fluorescence aussi en-dehors des contacts. C’est pourquoi on a choisi d’appliquer aux images deux types de traitement, afin d’analyser les deux phénomènes indépendamment : recrutement d’actine spécifiquement au niveau des contacts et plus globalement dans le réseau.

4.1.2.1 Définition des zones d’intérêt

Dans les deux cas, la procédure commence par définir dans l’image plusieurs zones d’intérêt (ROI, pour "Regions of Interest"), représentées sur la figure 4.2. Pour étudier la zone située autour de la bille, on utilise 9 disques concentriques autour de la bille : ROIi, i = 1 à 9. Leurs

rayons vont de R1 = 2, 25 µm à R9 = 6, 25 µm, avec Ri+1− Ri = 0, 5 µm. Pour s’affranchir du

photoblanchiment qui pourrait avoir lieu pendant l’expérience, on mesure l’intensité lumieuse dans une zone contrôle : ROIbleach. C’est un petit disque positionné dans la cellule, mais suffi-

samment loin de la bille pour ne pas être sensible à l’application de la force (en général, on le prend juste après le dernier disque ROI9).

Fig. 4.2 – Définition des zones d’intérêt pour l’analyse des images : cliché en transmission pour repérer la position de la bille (gauche) ; et cliché en épifluorescence après lissage, avec les zones ROIi en jaune (pour i = 1, 2 et 9) et la zone ROIbleach en orange (droite).

A chaque temps tn, après avoir moyenné les images des 4 plans d’intérêt, lissé l’image résul-

tante et défini les ROI, on mesure l’intensité moyenne des pixels contenus dans ROIbleach: Ibleach.

Cette valeur fait office de référence de l’intensité de fluorescence dans la partie non perturbée de la cellule au cours du temps.

4.1.2.2 Quantité d’actine contenue dans les contacts

Afin d’évaluer la quantité d’actine contenue dans les contacts, on s’est inspiré des techniques de détection et d’analyse utilisées par Zamir et coll. [137].

On applique à l’image, après les traitements décrits précédemment, une soustraction du fond (afin d’éliminer le signal correspondant à l’actine présente dans la cellule sous forme diffuse), ainsi qu’un seuillage. On obtient alors une image comme celle représentée sur la figure 4.3 : on peut ainsi isoler les différents patches présents au contact bille-cellule. On ne garde pour cela que les points brillants contenus dans dans la zone ROI1. Chaque patche est identifié et indexé (par

un indice p).

On utilise ensuite le masque correspondant à sa surface pour mesurer, sur l’image de départ (avant soustraction du fond et seuillage), le nombre de pixels Npet l’intensité lumineuse moyenne

contenue dans ce patche : Ip. L’estimation de la quantité totale d’actine contenue, au temps tn,

dans les FA vaut :

Q(tn) = 1 Ibleach(tn) X p Np(tn)Ip(tn) . (4.1)

Fig. 4.3 – Le même cliché que celui de la figure 4.2, après lissage, soustraction du fond et seuillage : on voit nettement les patches d’actine correspondant aux contacts, situés dans la zone ROI1.

Comme on l’avait fait pour le module élastique, on définit aussi la valeur normalisée q(t) par : q(tn) = Q(t) − min(Q)

max(Q) − min(Q) (4.2)

de façon à avoir une quantité adimensionnée et variant entre 0 et 1. Les valeurs min et max sont prises sur l’ensemble des Q(tn) (n = 1, N ) mesuré pour cette cellule au cours du temps.

On utilise aussi les masques obtenus après seuillage pour ajuster chaque patche par une ellipse, dont on peut repérer la position (Xp, Yp), la taille des petit et grand axes (ap, Ap), et

l’orientation θp à chaque temps tn.

4.1.2.3 Densité d’actine dans le réseau du cytosquelette

Afin de mesurer la densité d’actine contenue dans le réseau du cytosquelette à courte et moyenne portée autour de la bille, on utilise les zones ROI1 à ROI9. Comme les dernières

couronnes sont relativement grandes par rapport à la taille de la bille, elle contiennent souvent une certaine zone hors de la cellule. Afin de ne pas prendre en compte cette zone dans les mesures, on applique à l’image un seuillage très bas, juste au-dessus du niveau du fond : toute la cellule est ainsi prise en compte pour les mesures d’intensité, mais pas le fond.

Le disque ROI1, de surface environ 1,6 fois celle de la bille est pris comme zone de référence

pour le calcul de la densité moyenne d’actine autour de la bille, Q′ _:

Q′(tn) =

N1(tn) I1(tn)

Ibleach(tn)

(4.3) où I1 est l’intensité moyenne sur les pixels (en nombre N1) contenus dans ROI1. Pour chaque

disque, on calcule de la même façon l’intensité lumineuse Ii ainsi que l’aire de cellule πR2i, c’est-

à-dire le nombre de pixels Ni, qu’il contient et on en déduit une densité d’actine Q′i.

On définit ensuite les couronnes situées entre deux disques successifs : de rayons moyens ri = (Ri+1+ Ri)/2 et d’épaisseur δRi = Ri+1− Ri = 0, 5 µm, elles contiennent une intensité de

fluorescence moyenne δQ′ i : δQ′_i(tn) = Q′ i+1(tn) − Q′i(tn) π R2 i+1− R2i
. (4.4)