Analyse protéique par Western-Blot dans la muqueuse colique

L’expression de marqueurs de l’inflammation a été étudiée dans la muqueuse colique de toutes les souris inclues dans le protocole in vivo afin d’évaluer l’activation du processus inflammatoire au niveau local.

Chez les mâles, en l’absence de traitement colitogène, aucune modification de la quantité des cytokines inflammatoires n’a été observée avec les régimes hypercaloriques. Chez ceux ayant consommé le régime hyperlipidique, l’expression de TNF-α est augmenté d’un facteur 2 sous l’effet du DSS mais pas de manière significative (Figure 50 C). Curieusement, chez ceux ayant consommé le régime hyperglucidique, nous observons une légère diminution de la quantité de TNF-α dans le côlon après traitement au DSS par rapport aux souris non traitées nourries avec le régime hyperglucidique.

La quantification de l’IL-1β dans la muqueuse colique des mâles traités avec le DSS a montré une augmentation par rapport à ceux non traitées (Figure 50 B). L’expression de cette cytokine ne semble en revanche pas affectée par la consommation des régimes hypercaloriques.

Nous avons également étudié deux marqueurs anti-inflammatoires. L’expression de TGF-β ne semble pas modifiée dans aucun des groupes (Figure 50 F). En revanche, la quantité d’IL-10 est nettement diminuée par le DSS et d’autant plus chez les mâles ayant consommé le régime enrichi en sucre (Figure 50 E).

Chez les femelles, nous n’avons réalisé les analyses que dans les groupes contrôle et hyperglucidique car deux animaux sont décédés dans le groupe hyperlipidique. (Figure 50 G). En l’absence de DSS, on observe une hausse importante du niveau d’expression d’IL-10 chez les femelles ayant consommé le régime hyperglucidique. Après traitement par le DSS, la quantité d’IL-10 semble diminuer lorsque les animaux ont consommé le régime enrichi en

sucre, toutefois cette baisse n’est pas vérifiée statistiquement (p = 0,07) (Figure 50 I).

Concernant la quantité de TGF-β, elle semble augmenter dans la muqueuse des femelles ayant consommé le régime hyperglucidique, mais cette hausse n’est pas significative (Figure 50 H).

Figure 50 : Étude de l’effet des régimes et du DSS sur l’expression des protéines de l’inflammation dans la muqueuse colique des souris.

L’expression des protéines

d’intérêt a été rapportée à celle de la β-actine utilisée comme protéine de référence. Les résultats concernent les les souris mâles (A-F) et femelles (G-I) traitées ou non au DSS ayant été consommé le régime contrôle (C), hyperlipidique (HL), et hyperglucidique (HG).

Les résultats présentés

correspondent aux moyennes des mesures densitométriques normalisées ± erreur standard. Pour chaque régime, la significativité des différences observées entre les animaux traités avec le DSS et les animaux non traités a été établie par un test t de Student (* p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001).

• Étude de l’expression des marqueurs de l’autophagie

L’expression de marqueurs de la macro-autophagie (ATG13, ATG5, LC3 II / LC3 I), de la CMA (HSPA8) et HSP 90 (impliqué dans les 2 voies considérées) a été étudiée dans les côlons de toutes les souris inclues dans le protocole in vivo afin de vérifier l’implication du processus autophagique dans la réponse au DSS et l’impact des régimes hypercaloriques sur ce mécanisme cellulaire.

En l’absence de traitement colitogène, aucune variation significative des marqueurs de la macro-autophagie n’a été mise en évidence en fonction des régimes alimentaires. De même, la consommation du régime hyperglucidique ne semble pas provoquer de changement dans l’expression des marqueurs de la CMA. En revanche, la consommation du régime

hyperlipidique entraine une modification de la quantité de HSP90 (- 21 %) et de HSPA8

(+ 42 % ; Figure 51 B et C).

Contrairement à nos attentes, nous n’avons pas observé de modification significative de la quantité des marqueurs de l’autophagie pour les animaux ayant consommés le régime contrôle lorsqu’ils ont été traités avec le DSS (Figure 51). Le régime hyperlipidique ne modifie pas sensiblement l’effet du DSS observé avec le régime de référence sauf au niveau de l’expression du marqueur ATG13 (Figure 51 E). En revanche, la quantité de HSP90, ATG5 et ATG13 est

apparue comme étant diminuée chez les animaux traités avec le DSS qui ont consommé le régime hyperglucidique par rapport aux animaux sains (Figure 51 B, E, F).

En raison d’un problème d’anticorps, les protéines ATG13 et HSP90 n’ont pas pu être répliqués. En revanche, concernant ATG5, HSPA8 et LC3 nous obtenons des résultats discordants : tout d’abord on observe une augmentation de la quantité d’ATG5 chez les animaux ayant consommé le régime normal et traités au DSS (Figure 51 M) que nous n’avions pas observé précédemment et nous ne retrouvons pas la diminution observée chez les animaux ayant consommé le régime hyperglucidique. Concernant HSPA8 et LC3 (Figure 51 K et L), comme précédemment nous n’avons pas observé de modification significative. Deux autres marqueurs de l’autophagie ont été étudiés. La consommation des régimes ne semble pas modifier l’expression d’ULK1 (Figure 51 J), par contre nous observons une diminution d’ATG16L1 chez les animaux traités au DSS ayant consommé le régime hyperglucidique (Figure 51 I).

Figure 51 : Étude de l’effet des régimes et du DSS sur l’expression des protéines de l’autophagie dans la muqueuse colique des mâles. La quantité des protéines d’intérêt a été rapportée à celle de la β-actine

utilisée comme protéine de référence. Les résultats concernent les mâles traités ou non au DSS ayant été soumis au régime normal (C), hyperlipidique (HL), et hyperglucidique (HG). Les résultats présentés correspondent aux moyennes des mesures densitométriques normalisées ± erreur standard. Pour chaque régime, la significativité des différences observées entre les animaux traités avec le DSS et les animaux non traités a été établie par un test t de Student (* p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001).

Chez les femelles, aucun effet significatif n’a été observé quel que soit le marqueur étudié

(Figure 52). Cependant les expériences n’ont été réalisées qu’une seule fois, des répliquas seront nécessaires pour confirmer ou non ces résultats.

Figure 52 : Étude de l’effet des régimes et du DSS sur l’expression des protéines de l’autophagie dans la muqueuse colique des femelles. La quantité des protéines d’intérêt a été rapportée à celle de la

β-actine utilisée comme protéine de référence. Les résultats concernent les femelles traités ou non au DSS ayant été soumises au régime normal (C), hyperlipidique (HL), et hyperglucidique (HG). Les résultats présentés correspondent aux moyennes des mesures densitométriques normalisées ± erreur standard. Pour chaque régime, la significativité des différences observées entre les animaux traités avec le DSS et les animaux non traités a été établie par un test t de Student.