Analyse de la protéine aIF2α3 avec une étiquette poly-histidines

Pour rendre l‟étude du phénomène de « scrambling » plus facile à mettre en évidence, l‟article de I. Kaltashov (10) se basait sur l‟utilisation d‟une étiquette poly-histidines placée à l‟extrémité soit N- soit C-terminale de la protéine qu‟ils ont étudiée. L‟intérêt était que ces segments sont connus comme étant non structurés et qu‟on peut par conséquent prédire que la vitesse d‟échange y sera maximale par rapport à la partie structurée de la protéine. Dans le cadre de leurs expériences, la protéine est initialement totalement marquée par des deutériums par dissolution dans du D2O et l‟incubation se fait en conditions natives après dilution dans un

tampon H2O, 10 mM acétate d‟ammonium. De ce fait, on attend une perte rapide de la

deutération sur l‟extrémité poly-histidines des protéines. Ils observent ainsi (Fig. III. 33) que l‟activation par CID conduit à un « scrambling » important pour les états de charge faibles (9+ à 11+) alors qu‟il est nettement réduit pour les états de charge 14+ à 20+.

Nous avons souhaité construire un système équivalent pour notre protéine aIF2α3 afin de voir si nous aussi en CID pouvions mettre en évidence la présence de « scrambling » ou non. Pour cela, nous avons construit un mutant de la protéine aIF2α3 et l‟avons exprimé en collaboration avec le Laboratoire de Biochimie de l‟École Polytechnique. La séquence de ce mutant est donnée sur la Fig. III. 34.

140 2,2 D 11 D Avec Redistribution des D Sans redistribution des D

Segment non structuré de 21 acides aminés

Fig. III. 33 Nombre moyen de deutériums pour le fragment b19 en fonction de l’état de charge

de l’ion précurseur. Les lignes horizontales en gris indiquent le nombre moyen de deutériums calculé dans le cas d’une redistribution aléatoire totale des hydrogènes et deutériums labiles au sein de l’ion précurseur avant la dissociation (en haut) et dans le cas de l’absence de phénomène de « scrambling » (en bas).

Fig. III. 34 Séquence d’aIF2α3 comportant l’étiquette poly-histidines (acides aminés en vert). En rose, les fragments étudiés par HDX/CID.

Notons dès maintenant qu‟il nous était impossible de reproduire exactement l‟expérience d‟I. Kaltashov avec notre protéine : en effet, elle est instable dans des conditions non-salines et ne peut être lyophilisée. Par conséquent, il sera nécessaire de procéder par un double échange tel que fait jusqu‟à présent, i.e. commencer par diluer la protéine dans une solution D2O, NaCl 330 mM puis arrêter l‟échange par une dilution ½ dans une solution H2O, acide

formique 2% avant de procéder au dessalage sur colonne. De ce fait, on ne profite plus de l‟aspect déstructuré de la chaîne poly-histidines (qui sera rapidement deutérée dans l‟étape d‟échange) mais de la grande vitesse de ré-échange de la chaîne poly-histidines une fois celle- ci placée en condition d‟arrêt, tel qu‟observé sur les peptides de T. Jørgensen au Chap. II. On peut considérer que l‟échange inverse (« back-exchange ») sera, de la même façon que pour le

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peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) nettement plus rapide sur la partie poly-histidines que sur le reste de la séquence protéique.

Nous avons ensuite étudié par HDX/CID les fragments b2-10, correspondant aux fragments

situés dans l‟étiquette poly-histidines (en vert sur Fig. III. 34), ainsi que les fragments communs avec ceux de la protéine sans poly-histidines, soit les fragments b21-22 et b28,

correspondant aux fragments b9-10 et b16 de la protéine sans étiquette poly-histidines. Les

résultats obtenus sont présentés dans la Fig. III. 35. Ils sont comparés à ceux de la Fig. III. 32.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 Courbe théorique 17+ 16+ 15+ 14+ 13+ 17+ 14+ 16+ 15+ 17+ 14+ 16+ 15+ N om br e d e d eut ér ium s Numéro du résidu

Fig. III. 35 Représentation du nombre total de deutériums contenus dans les ions b issus de la fragmentation de l’ion précurseur dans les états de charge 13+ à 17+, en fonction de leur position dans la séquence (numéro de résidu). La protéine « taggée » a été incubée pendant une heure dans D2O. Son analyse en MS révèle un pourcentage de deutération de 57%.

On constate tout d‟abord que les fragments b2 à b10 présentent un taux de deutération

largement inférieur (jusqu‟à 2 D d‟écart pour b10) à la courbe de « scrambling » complet. Ceci

montre deux choses. Le premier résultat est que le « scrambling » est très loin d‟être total sur cette région. Par conséquent, même en cas de « scrambling » partiel, ce résultat ne peut être obtenu que si la deutération locale est très inférieure à la moyenne sur l'ensemble de la protéine. On peut donc en déduire ce second résultat : comme nous l'avions espéré, un « back- exchange » rapide des hydrogènes d'amide des histidines a bien eu lieu. On ne peut pas, par contre, savoir si ce « back-exchange » a été total ou pas. On note par ailleurs que dans cette

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partie de la protéine, l‟état de charge ne semble pas jouer un rôle important sur la deutération, nettement moins en tout cas que les effets observés pour la protéine sans étiquette.

Si on s‟intéresse maintenant aux fragments b21-22 et b28, on constate une dispersion des

niveaux de deutération nettement réduite par rapport à celle de la protéine non-marquée et en tout cas sans aucune rupture brutale similaire à celle présentée dans l‟article d‟I Kaltashov. Il est par contre difficile de comparer un à un les niveaux de deutération car on ne connaît pas a

priori le niveau de deutération restant sur la partie poly-histidines. Toutefois on notera

qu‟entre les fragments b22 et b28 de la protéine portant un His-tag on a 3,5 D de différence. On

retrouve une différence similaire entre les fragments b10 et b16 de la protéine portant un His-

tag.

Pour compléter ce travail, il nous manque un élément qui est la vérification du taux réel de deutération sur la partie poly-histidines. Ce travail reste à faire avec un suivi par ECD, en faisant l‟hypothèse d‟une absence de « scrambling » dans ce cas.

Mais au final une tendance nette semble néanmoins se dégager : dans une approche « top- down », l‟activation par CID ne conduit pas nécessairement à un « scrambling » total des deutériums d‟amide, au moins dans certaines conditions. L‟article d‟I. Kaltashov semble avoir identifié l‟état de charge comme étant un facteur. Dans notre cas, l‟état de charge ne semble pas jouer un rôle aussi marqué. Mais il faut noter d‟une part que l‟article d‟I. Kaltashov comme notre approche avec le His-tag n‟ont regardé le « scrambling » qu‟au niveau des extrémités de la protéine et d‟autre part que dans les deux cas, un « scrambling » partiel semble observé, puisqu‟il reste une fraction de deutériums au niveau de l‟extrémité.

III.3. Détermination du taux maximal de deutération : mise en