Analyse phylogénétique des communautés bactériennes associées à S. officinalis

L’analyse de la composition et de la structure des communautés bactériennes associées à l’éponge S. officinalis récoltée à Cortiou et Riou en 2011, 2012 et 2013 a été réalisée grâce à une électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE).

La DGGE est une méthode d’empreinte moléculaire qui permet d’évaluer la diversité microbienne dans une communauté complexe (Muyzer et al., 1993; Muyzer and Smalla, 1998). Cette technique simple et reproductible repose sur une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) suivi d’une électrophorèse sur gel qui contient un gradient linéaire d’agents

117 dénaturants. Les fragments d’ADN obtenus lors de l’amplification par PCR, et donc de tailles identiques, vont migrer le long du gradient en fonction de leur pourcentage en GC i.e. en fonction de leur séquence (Murray et al., 1996; Dı́ez et al., 2001).

Figure 27 : Profils RAPD et identification phylogénétique des souches isolées de S. officinalis. A Souches sélectionnées sur le nickel, B Souches sélectionnées sur le zinc, C Souches sélectionnées

118 Le résultat de la DGGE est un "patron de bandes" qui correspondent aux membres prédominants de la communauté bactérienne étudiée. Cette technique permet de comparer les dynamiques de communautés bactériennes sous l’effet de perturbations environnementales comme les saisons, la géographie ou la pollution (Müller et al., 2001; Chapon et al., 2012), d’investiguer la stabilité chez des organismes holobiontes comme les Spongiaires et leurs communautés microbiennes associées (Noyer et al., 2011).

L’ultime étape de caractérisation de ces communautés bactériennes est le séquençage des bandes de DGGE excisées du gel, ré-amplifiées par PCR et suivies d’un clonage et séquençage des produits de PCR. Le séquençage des bandes permet l’affiliation phylogénétique des espèces détectées (Muyzer et al., 1993).

Dans notre étude, les résultats générés par la DGGE ont été soumis à une analyse en composante principale afin d’avoir une confirmation statistique des observations réalisées sur le gel.

Le grand nombre de bandes observées sur les gels a permis de confirmer des observations microscopiques précédentes et de classer S. officinalis parmi les "High Microbial Abundance sponge" (Vacelet, 1975; Gerçe et al., 2011).

Nous avons aussi pu mettre en évidence une spécificité des empreintes correspondantes aux communautés associées à S. officinalis par rapport à celles de l’eau de mer environnante. Ce pattern était doublé d’une spécificité spatiale et temporelle qui pourrait être expliqué par la présence de métaux dans l’environnement. Par exemple, la structuration des communautés bactériennes associées aux échantillons de Cortiou en 2013 pouvait être corrélée à la présence de cuivre dans le milieu.

Sur les dix bandes sélectionnées, huit correspondaient à des espèces bactériennes impliquées dans le clustering par site et par année dans les échantillons d’éponges et deux dans les échantillons d’eau de mer à Cortiou en 2012 (Tableau 12).

Plusieurs séquences ont été identifiées pour chacun des des bandes RsB2011_1, RsB2011_2, CsB2012_7, CsB2012_8, Csw2012_9 and Csw2012_10.

Les bandes sélectionnées étaient dominées par deux phyla e.g. les Actinobacteria et les

Proteobacteria, qui sont couramment retrouvés dans les environnements marins et

particulièrement au sein des communautés associées aux éponges (Hentschel et al., 2012). Toutes les séquences ont été affiliées à des espèces cultivables et non cultivables, à l’exception de Csw-2012-9a. Huit classes bactériennes ont ainsi été mises en evidence, les

Acidobacteria, les Actinobacteria, les Chloroflexi, les Clostridia, les Gamma-proteobacteria,

119 Tableau 12 : Affiliation phylogénétique des séquences dérivées des bandes DGGE des communautés bactériennes associées à l’éponge S. officinalis et de l’eau de mer environnante. Rs

correspond aux échantillons récoltés à Riou, Cs à ceux de Cortiou et Csw aux échantillons d’eau de mer récoltés à Cortiou. Pour chaque séquence d’ADNr 16S, apparaissent les identités pour les bactéries cultivables et non cultivables.

Sequences No. acc. GenBank (longueur en pb)

Sequences avec la plus haute identité (%)

RSB2011_1a KF881017 (569) Acidithiomicrobium sp. GQ225720.1 (93)

Uncultured actinobacterium clone FJ229953.1 (94)

RSB2011_1b KF881018 (529) Thiohalophilus thiocyanatoxydans NR_043875.1 (92)

Uncultured bacterium clone GU981923.1 (95)

RSB2011_1c KF881019 (585) Pseudoalteromonas sp. HF912440.1 (97)

Uncultured bacterium clone JX206638.1 (99)

RSB2011_2a KF881020 (466) Ferrimicrobium sp. KF663614.1 (91)

Uncultured actinobacterium clone FJ229953.1 (97)

RSB2011_2b KF881021 (513) Actinomycetales bacterium DQ994722.1 (89)

Uncultured bacterium clone JX206733.1 (90)

CSB2011_3 KF881022 (477) Acidimicrobidae bacterium AY673309.1 (92)

Uncultured Acidimicrobidae bacterium clone JN596627.1 (100)

RSA2012_4 KF881023 (480) Psychrobacter sp. AB550521.1 (100)

Unidentified marine bacterioplankton clone KC000214.1 (100)

RSA2012_5 KF881024 (428) Desulfonatronum sp. HM750217.1 (87)

Uncultured bacterium clone JX206649.1 (99)

CSA2012_6 KF881025 (576) Candidatus Solibacter usitatus NR_074351.1 (85)

Uncultured bacterium clone EF159864.1 (98)

CSB2012_7a KF881026 (588) Acidimicrobium ferrooxidans EF621760.1 (90)

Uncultured actinobacterium clone JN113042.1 (99)

CSB2012_7b KF881027 (464) Iamia majanohamensis JQ899225.1 (90)

Uncultured bacterium clone JQ612206.1 (99)

CSB2012_7c KF881028 (468) Pseudoruegeria sp. KF303136.1 (98)

Uncultured bacterium clone JF261917.1 (100)

CSB2012_7d KF881029 (647) Desulfuromonas alkaliphilus NR_043709.1 (87)

Uncultured bacterium clone JX206632.1 (100)

CSB2012_8a KF881030 (578) Caldilinea aerophila NR_074397.1 (84)

Uncultured Chloroflexi bacterium clone JN596657.1 (98)

CSB2012_8b KF881031 (477) Thermacetogenium phaeum NR_074723.1 (81)

Uncultured marine bacterium clone JQ236295.1 (99)

CSW2012_9a KF881032 (380) Shewanella sp. KF009845.1 (100)

CSW2012_9b KF881033 (473) Aestuariibacter halophilus AY207503.2 (97)

Uncultured marine bacterium clone KF185806.1 (99)

CSW2012_10a KF881034 (478) Alteromonas sp. KF358313.1 (93)

Uncultured bacterium clone AY664267.1 (92)

CSW2012_10b KF881035 (466) Ruegeria sp. KC429937.1 (98)

Uncultured marine bacterium clone KF185986.1 (100)

Treize séquences, RsB2011_1a, RsB2011_1b, RsB2011_2a and 2b, CsB2011_3,

120 CsB2012_8b, Csw2012_10a, présentaient moins de 95% d’homologie avec les séquences obtenues dans GenBank. Ces séquences pourraient donc probablement être assignées à de nouvelles espèces bactériennes. Ces résultats doivent être modérés en raison du biais apporté par la relative courte longueur des fragments des séquences analysées.

Il est intéressant de noter que douze séquences présentent d’importantes similarités avec des séquences de bactéries marines non cultivables rencontrées chez des Démosponges. Trois des quatre séquences isolées à partir de l’eau de mer ont été attribuées à des bactéries marines non cultivables (Tableau 13).

Ces résultats supportent les observations précédentes d’une communauté bactérienne spécifique associée aux tissus d’éponges (Schmitt et al., 2012; Webster and Taylor, 2012).

Tableau 13 : Origine des bactéries présentant une homologie avec les séquences d’ADNr 16S obtenues à partir du gel DGGE des échantillons de S. officinalis.

Séquence Organisme hôte Origine Référence

D ém osp onge s RsB2011_1a, RsB2011_2a, CsB2011_3, CsA2012_6

Xetospongia muta Floride Montalvo and Hill, 2011

Schmitt et al., 2008

RsB2011_1b Haliclona logarthi Mer des Caraïbes Yang et al., 2011

RsB2011_1c, RsB2011_2b, RsA2012_5, CsB2012_7d

Ircinia oros Nord-ouest de la mer Méditerranée

Erwin et al., 2012

CsB2012_7a Astrosclera willeyana Mer de Chine

méridionale

Yang and Li, 2012

CsB2012_7b Geodia baretti Norvège Radax et al., 2012

CsB2012_8a Xetospongia testudinaria Indonésie Montalvo and Hill, 2011

Eau ^de m^er

Csw2012_9b, Csw2012_10b - mer Adriatique Vojvoda et al., 2014

Csw2012_10a - mer de Behring Jiao et al., 2007

4.3. Activités biologiques des souches bactériennes isolées

4.3.1. Evaluation de l’activité antioxydante

Sur l’ensemble des souches analysées, seulement huit extraits présentaient une activité antioxydante (Pseudovibrio sp. 2011SOCNI53, Paracuccus sp. 2011SOCNI19, Enterobacter sp. 2011SOCNI28, Citrobacter sp. 2011SOCNI44, Citrobacter sp. 2011SOCCUF1,

Escherichia sp. 2011SOCCUA11). Les pourcentages d’inhibition étaient peu significatifs et

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4.3.2. Evaluation de l’activité antimicrobienne

Les souches bactériennes analysées n’ont présenté aucune activité antifongique contre la levure Candida albicans et aucune activité antibactérienne contre la souche Escherichia

coli. Les extraits du surnageant de culture des souches Bacillus sp. 2011SOCPBJ6 et Escherichia sp. 2011SOCPBJ1 ont révélé des activité antimicrobienne significatives contre la

souche de Staphylococcus aureus avec 34% pour les extraits à l’acétate d’éthyle et respectivement 48% et 33% pour les extraits au butanol. Ces activités semblent intéressantes et ces résultats nécéssiteraient d’être approfondis (Tableau 14).

Tableau 14 : Récapitulatif des activités antioxydantes, antibactériennes et antifongiques des souches bactériennes isolées chez l’éponge marine S. officinalis. (-) pas d’activité, (+) active, a Test quantitatif au DPPH, b Test d’antagonisme contre la souche Staphylococcus aureus (ATCC 6538).

Souche Identification Bioactivité

Antioxydantea Antimicrobienneb 2011SOCNI53 Pseudovibrio sp. + - 2011SOCNI19 Paracuccus sp + - 2011SOCNI28 Enterobacter sp + - 2011SOCNI44 Citrobacter sp. + - 2011SOCCUF1 Citrobacter sp. + - 2011SOCCUA11 Escherichia sp. + - 2011SOCPBJ6 Bacillus sp. - + 2011SOCPBJ1 Escherichia sp. - +

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CHAPITRE 2 : Pseudovibrio sp., une bactérie associée à Spongia officinalis