O papel da inflamação crônica na carcinogênese tem sido investigado nos últimos anos, e os dados clínicos e experimentais indicam que o microambiente inflamatório pode auxiliar na sobrevivência e proliferação das células malignas, aumentando o risco de desenvolvimento e contribuindo para a progressão de muitos tipos de câncer (MANTOVANI et al., 2010; GRIVENNIKOV; KARIN, 2010). Neste contexto, a investigação do perfil de expressão das proteínas AnxA1 e Gal-1, importantes moduladores da resposta inflamatória, pode revelar alterações relacionadas à progressão neoplásica.
No presente estudo, foram avaliados os níveis de expressão gênica e proteica da AnxA1 e Gal-1 e a proliferação celular durante a progressão do CCR esporádico, incluindo a mucosa normal, a lesão pré-neoplásica adenomatosa e o ADC. De modo geral, foram observados 60,5% dos casos de ADC hiperexpressos para
ANXA1, com aumento de 2,33 vezes em relação à expressão na mucosa normal
adjacente e ao AD, que também apresentou hiperexpressão de ANXA1 quando comparado ao respectivo tecido normal (RQ=1,11). Da mesma forma, a imunomarcação da AnxA1 foi forte no epitélio e no estroma do ADC em comparação à lesão adenomatosa. Para Gal-1, os níveis de mRNA no ADC evidenciaram aumento de 1,85 vezes (46,5% dos casos hiperexpressos) em relação à mucosa normal adjacente e ao AD, que apresentou expressão basal (RQ=0,90). A análise imuno-histoquímica revelou expressão moderada no epitélio e estroma de ambas as lesões, similarmente ao observado nas respectivas mucosas normais. Além disso, foi constatada uma significante proliferação celular evidenciada pela imunomarcação do antígeno Ki-67 em ambas as lesões, porém, mais acentuada no tecido tumoral.
Vários estudos têm confirmado que alterações na expressão da AnxA1 estão associadas ao desenvolvimento do câncer. No entanto, a ausência de um padrão sugere que seu aumento ou diminuição possa ser tecido-específica (KANG et al., 2012). Em câncer de mama, por exemplo, foi relatado redução considerável ou perda de expressão (WANG et al., 2010; YOM et al., 2011). A hipoexpressão da AnxA1 foi também encontrada em carcinoma de células escamosas de esôfago (XIA et al., 2002; HU et al., 2004), neoplasias de cabeça e pescoço (PEDRERO et al., 2004), próstata (XIN et al.,
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2003; PATTON et al., 2005), tireoide (PETRELLA et al., 2006), laringe (SILISTINO- SOUZA et al., 2007; ALVES et al., 2008), cólo de útero (WANG et al., 2008), cavidade oral (FARIA et al., 2010) e ADC sinonasal (RODRIGO et al., 2011). De modo contrário, um aumento da expressão da AnxA1 foi observado em leucemia (FALINI et al., 2004), câncer de pâncreas (BAI et al., 2004), esôfago (WANG et al., 2006), pulmão (LIU et al., 2011), bexiga (KANG et al., 2012), estômago (SATO et al., 2011; CHENG et al., 2012), como também em ADC de estômago e gastrite crônica, como relatado pelo nosso grupo de pesquisa recentemente (JORGE et al., 2013).
No CCR, a maioria dos estudos são concordantes quanto ao aumento da expressão da AnxA1, similar ao presente estudo. Duncan et al. (2008) observaram aumento da expressão dessa proteína em tumores primários comparados ao cólon normal, enquanto He et al. (2010) constataram hiperexpressão proteica em linfonodos sentinela com micrometástases, comparados aos linfonodos normais. Posteriormente, Sato et al. (2011) encontraram expressão elevada da proteína AnxA1 no tecido com CCR e relacionaram-na com o gênero feminino, invasão linfática e venosa, metástases e estadiamento tumoral. No entanto, o mesmo não foi observado para a expressão gênica, que não revelou diferenças em relação à mucosa normal. Uma importante evidência da associação entre a expressão da AnxA1 e o CCR foi relatada por Su et al. (2010) que observaram aumento da expressão gênica e proteica associada a mutações no proto- oncogene KRAS, as quais são frequentes nos indivíduos com esse tipo de neoplasia.
Para a lesão pré-cancerosa adenomatosa, os estudos ainda são escassos, com exceção de Roth et al. (2010) que, ao investigarem proteínas diferencialmente expressas em linhagens celulares humanas singênicas de AD (AA/C1) e ADC (AA/C1/SB10C), mostraram elevação da expressão da AnxA1 na sequência AD-ADC. No presente estudo, foi relatado pela primeira vez em tecido primário a hiperexpressão do mRNA da AnxA1 em 33,3% das amostras de AD colorretal, com leve aumento relativo de 1,11 vezes, mas significante em relação ao tecido normal adjacente. A análise imuno- histoquímica confirmou esses dados com imunomarcação moderada da AnxA1 no epitélio glandular e no estroma do AD.
Quanto à localização da AnxA1, foi constatado imunorreatividade elevada no núcleo e citoplasma do epitélio e no estroma do tecido tumoral. Outros trabalhos em CCR têm também destacado que essa proteína é expressa, principalmente, no núcleo e
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no citoplasma das células cancerosas (HE et al., 2010; SATO et al., 2011), mas pode ser encontrada no tecido conectivo em algumas amostras (SATO et al., 2011). De acordo com Hayes e Moss (2004), além de alterações no nível de expressão da AnxA1, sua localização pode também contribuir para as condições patológicas, como o câncer. Em um estudo recente, Yi (2012) apresentou uma lista de genes com expressão alterada no estroma tumoral em camundongos knockout para AnxA1, mostrando que esta proteína afeta o desenvolvimento tumoral e metástase pela interação com o microambiente ao redor das células tumorais. Apesar dos mecanismos de externalização da AnxA1 não estarem totalmente esclarecidos, sabe-se que eles envolvem, principalmente, a elevação intracelular de Ca2+ e a fosforilação (GERKE; CREUTZ; MOSS, 2005), processos esses que podem estar alterados no câncer.
De modo geral, no presente estudo, a análise proteica da AnxA1 apresentou resultados concordantes com a análise de expressão gênica, evidenciando um aumento gradual durante a progressão da carcinogênese colorretal esporádica, sugerindo, assim, que esta proteína deve exercer alguma contribuição durante a transformação celular maligna, desde as etapas iniciais, a partir do AD e sua progressão para ADC.
Em relação à expressão da Gal-1, a maioria dos estudos relata aumento dos níveis de mRNA e da proteína associado ao câncer. A hiperexpressão do gene LGALS1 foi descrita em carcinoma hepatocelular (SPANO et al., 2010) e relacionada aos processos de migração e invasão do tumor. Outro estudo em câncer de mama (JUNG et al., 2007) associou a expressão elevada da Gal-1 à diferenciação tumoral, ao estadiamento e à metástase. O aumento da expressão dessa proteína também foi observado em câncer de hipofaringe e laringe (SAUSSEZ et al., 2008), carcinoma oral (DING et al., 2009; ALVES et al., 2011), nasofaringeal (TANG et al., 2010) e câncer de próstata (LADERACH et al., 2012). Kim et al. (2013) mostraram que níveis elevados da Gal-1 está funcionalmente envolvido na proliferação e invasão do câncer cervical. De modo contrário, estudos que relatam a hipoexpressão da Gal-1 são escassos. Por exemplo, Rodig et al. (2008) observaram expressão elevada da Gal-1 em linfoma de Hodgkin clássico, e ausência de expressão em outras formas de linfomas de Hodgkin. Em câncer gástrico, apenas 18,3% (17/93) dos tumores avaliados apresentaram expressão da Gal-1, que variou de imunomarcação moderada (14 casos) a fraca (três casos) (BEKTAS et al., 2010).
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No CCR, ao contrário do presente trabalho, Sanjuán et al. (1997) constataram que a expressão proteica da Gal-1 aumenta progressivamente da mucosa normal (12%) para o AD (40%) e para o ADC (84%), e relacionaram-na com as etapas da progressão do tumor, enquanto Hittelet et al. (2003) mostraram que a proporção de casos com expressão elevada da Gal-1 aumentou significantemente com o grau de displasia dos ADs, sugerindo, assim, que essa proteína pode estar relacionada a progressão neoplásica. Recentemente, Sheng et al. (2012) observaram que a intensidade da imunomarcação da Gal-1 aumentou do AD para o ADC colorretal e foi correlacionada com o estadiamento e invasão do tumor. Porém, os autores não encontraram aumento correspondente de expressão do mRNA, sugerindo que a elevação da expressão proteica seja, provavelmente, detectada em decorrência da secreção da Gal-1 de outros tecidos que se acumulam no estroma do tumor. Contudo, Watanabe et al. (2008) pesquisando genes diferencialmente expressos em amostras de CCR, evidenciaram expressão elevada do gene LGALS1, similar ao presente estudo, e o indicaram como um dos possíveis candidatos a marcador desse tipo tumoral. Os mesmos autores mostraram, em um estudo recente, que o nível da proteína Gal-1 circulante no plasma de pacientes com este tipo de câncer apresentou-se elevado em relação ao grupo controle, diminuindo após cirurgia, sugerindo, com isso, que essa proteína pode ser utilizada para o rastreamento do tumor (WATANABE et al., 2011).
Quanto à localização da Gal-1 no CCR, ainda não há um consenso. Estudos relatam imunomarcação principalmente no estroma (SANJUÁN et al., 1997; ZHAO et al., 2010; WATANABE et al., 2011; SHENG et al., 2012), ou no epitélio e estroma (HITTELET et al., 2003; NAGY et al., 2003), como no presente estudo. Satelli e Rao (2011) sugeriram que estas diferenças quanto à localização são reflexos da heterogeneidade dessa doença. A Gal-1 quando externalizada pode, por exemplo, induzir a apoptose das células T ativadas e auxiliar no processo angiogênico, enquanto que, intracelularmente, ela inibe a proliferação e induz a apoptose das células tumorais no CCR (SATELLI; RAO, 2011; BARROW; RHODES; YU, 2011). Em contraste, Zhao et al. (2010) mostraram que a migração e a invasão das células cancerosas na mucosa colorretal pode ser inibida pelo silenciamento gênico da Gal-1 por shRNA específicos. Portanto, não há um consenso quanto ao papel funcional dessa proteína nas células tumorais em CCR.
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Apesar de a literatura relatar um aumento progressivo da expressão proteica da Gal-1 do AD para ADC, no presente estudo, ambas as lesões apresentaram expressão moderada. Porém, a quantificação do mRNA de LGALS1 revelou aumento significante no tecido tumoral, indicando, dessa forma, que a elevação dos níveis de expressão pode estar associada às etapas mais avançadas da carcinogênese colorretal esporádica. Alterações na expressão de LGALS1 também pode ser relacionada ao grau de diferenciação do CCR, como destacado por Zhu, Liang e Ding (2007), que observaram níveis de mRNA significantemente maiores em ADCs pouco diferenciados, invasivos e metastáticos em relação aos diferenciados, não-invasivos e livres de metástases.
Como os níveis de expressão do mRNA de ANXA1 e LGALS1 apresentarem-se hiperexpressos no ADC colorretal, foi avaliada a ocorrência de correlação entre eles, que apresentou-se positiva (r=0,73). Dessa forma, sugere-se que ambos os genes podem atuar em vias importantes, contribuindo para o processo carcinogênico, como proliferação celular, apoptose, angiogênese e metástase
(MUSSUNOOR; MURAY, 2008; LIU; RABINOVICH, 2005). Liang, Qu e Ding
(2007), a partir da investigação de genes e proteínas diferencialmente expressos em duas linhagens de células de CCR (SW620 e SW680) com diferentes potenciais metastáticos, evidenciaram, dentre 16 proteínas hiperexpressas, a AnxA1 e a Gal-1, assim como outras com funções relacionadas à adesão, diferenciação, proliferação e migração celular, transdução de sinal e evasão da resposta imune. Em conjunto, esses resultados sugerem que a AnxA1 e Gal-1 devem exercer funções importantes e complementares nas vias de sinalização celular do processo carcinogênico.
O papel da AnxA1 na proliferação celular está relacionado à ativação da cascata de sinalização MAPK/ERK (proteína quinase ativa por mitógeno/quinase regulada por sinais extracelulares). A AnxA1 também exerce atividade anti-proliferativa devido à inibição da ciclina D1 ou à indução da desorganização do citoesqueleto mediada pela via ERK1/2, que também interfere nos mecanismos de transformação e diferenciação celular (ALLDRIDGE; BRYANT, 2003). Em linhagens tumorais de mama positivas e negativas para receptores de estrógeno (MCF-7 e MDA-MB-231) expostas a diversos estímulos mitogênicos, Khau et al. (2011) mostraram que o efeito proliferativo da AnxA1 no câncer pode ser via ativação dos receptores FPR1 e FPR2. Para Gal-1, estudos em câncer colorretal e hepatocelular mostram que sua participação
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na via ERK1/2 favorece a adesão aos componentes da matriz extracelular como, por exemplo, as integrinas, auxiliando, assim, no desenvolvimento do tumor (HORIGUCHI et al., 2003; ESPELT et al., 2011; BARROW; RHODES; YU, 2011).
A investigação da associação dos níveis de expressão do mRNA de ANXA1e
LGALS1 com as variáveis de risco como idade, tabagismo e etilismo e com o sítio
anatômico de origem da lesão nos grupos AD e ADC não mostrou dados relevantes. Entretanto, foi observado que a expressão gênica de ANXA1 apresentava-se duas vezes maior no gênero feminino em relação ao masculino (RQ=3,61 versus 1,79) do grupo de indivíduos com ADC. Apesar de Sato et al. (2011) também relatarem essa associação em indivíduos com CCR, o resultado não foi discutido pelos autores. De modo contrário, Faria et al. (2010) encontraram baixa expressão desse gene em mulheres com carcinoma oral. Porém, recentemente, nosso grupo de pesquisa descreveu achado similar ao presente estudo em pacientes com câncer gástrico e sugeriram que alterações na expressão de ANXA1 podem estar relacionadas às diferenças hormonais entre os gêneros (JORGE et al., 2013).
Ang et al. (2009), após tratamento da linhagem celular MCF-7 de câncer de mama com estrógeno, observaram um aumento na expressão gênica de ANXA1 provavelmente devido a ligação do 17β-estradiol (metabólito ativo do estrógeno) ao seu receptor. Os autores também notaram que a ativação da transcrição gênica de ANXA1 provocou a inibição do crescimento celular e sugeriram que ANXA1 modula a função proliferativa do estrógeno e age como um gene supressor de tumor nesse tipo de câncer. Porém, como o perfil de expressão gênica difere entre esse tipo tumoral e o CCR, mais investigações são necessárias para elucidar essa questão.
Devido ao envolvimento das proteínas AnxA1 e Gal-1 nos processos que levam a formação do tumor, foi avaliado neste estudo o índice de proliferação celular durante a sequência: mucosa normal-AD-ADC. O resultado revelou que 100% das amostras apresentaram imunopositividade nuclear ao Ki-67 acima de 10%, conforme era esperado, uma vez que as criptas do epitélio intestinal da mucosa normal encontram- se naturalmente em constante estado de proliferação (PINHO, 2009). Contudo, enquanto na mucosa normal de ambas as lesões 100% das amostras apresentaram IP variando entre 10 e 49%, em AD e ADC foram observadas frequências maiores de
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casos com IP acima de 50% (68,4% e 88%, respectivamente), evidenciando, assim, um aumento progressivo.
Na literatura, a variação do IP no AD colorretal foi constatada entre 49% (SOUSA et al., 2012) e 59% (SOUSA-JÚNIOR et al., 2010), similar ao observado no presente trabalho. Contudo, tais valores podem também variar conforme o grau de displasia e o sítio anatômico da lesão, como mostrado por Sousa et al. (2012) que encontraram IP significantemente maior nos ADs com alto grau de displasia (IP=56%) em comparação aos de baixo grau (IP=45%) e localizados no reto (IP=57%). Porém, outros autores relataram valores de IP menores, iguais a 13,9% e 33,2% em AD com baixo e alto grau de displasia, respectivamente (NUSSRAT et al., 2011). Em ADC colorretal, alguns estudos têm relacionado a imunomarcação do Ki-67 com a doença. Menezes et al. (2010), por exemplo, observaram que 75,6% das amostras de ADC colorretal apresentaram positividade nuclear e estavam associadas à recorrência do tumor, enquanto Andrade et al. (2011) demonstraram que pacientes tratados com quimio-radioterapia neoadjuvante expressaram menor porcentagem de positividade ao Ki-67 e melhor prognóstico. De modo geral, os resultados da análise de proliferação celular são concordantes com a literatura, que relata um aumento progressivo durante a típica sequência adenoma-adenocarcinoma do CCR esporádico.
Sabe-se que os pólipos colorretais são frequentes na população em geral (CERATO et al., 2007). Estudos revelam que mesmo após a polipectomia, muitos pacientes têm um risco aumentado de desenvolver novamente ADs e também o CCR (LESLIE; STEELE, 2002). Assim, o diagnóstico anatomopatológico é importante para direcionar o manejo clínico dos pacientes com essas lesões, seja AD ou ADC, mostrando que a precisão diagnóstica é fundamental para que seja oferecida a melhor opção terapêutica (CERATO et al., 2007). Nesse contexto, a precisa avaliação das características moleculares é essencial na indicação de biomarcadores para avaliação de risco do CCR precoce (LEE, 2012).
Embora as investigações indiquem a AnxA1 e a Gal-1 como possíveis marcadores moleculares desse tipo de neoplasia (MUSSUNOOR; MURAY, 2008; WATANABE et al., 2008), suas funções ainda não estão completamente elucidadas, justificando, assim, estudos futuros que possam evidenciar os mecanismos de ação e vias de sinalização celular em que participam.
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